{"id":341221,"date":"2016-07-20T02:00:00","date_gmt":"2016-07-20T00:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/medizinonline.com\/nueva-dimension-del-analisis-predictivo-no-invasivo-de-marcadores-en-tumores\/"},"modified":"2016-07-20T02:00:00","modified_gmt":"2016-07-20T00:00:00","slug":"nueva-dimension-del-analisis-predictivo-no-invasivo-de-marcadores-en-tumores","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/medizinonline.com\/es\/nueva-dimension-del-analisis-predictivo-no-invasivo-de-marcadores-en-tumores\/","title":{"rendered":"Nueva dimensi\u00f3n del an\u00e1lisis predictivo no invasivo de marcadores en tumores"},"content":{"rendered":"

En el diagn\u00f3stico de tumores, el t\u00e9rmino biopsias l\u00edquidas hace referencia al an\u00e1lisis del ADN circulante libre de c\u00e9lulas (cfADN) y de las c\u00e9lulas tumorales circulantes. Hoy en d\u00eda es posible detectar las mutaciones de un tumor avanzado de forma m\u00ednimamente invasiva mediante an\u00e1lisis de cfADN. Para las pruebas de cfADN debe utilizarse plasma, no suero. Las c\u00e9lulas tumorales circulantes podr\u00e1n utilizarse en un futuro pr\u00f3ximo para el an\u00e1lisis de marcadores predictivos, como para la determinaci\u00f3n de la variante de empalme AR-V7 en el carcinoma de pr\u00f3stata resistente a la castraci\u00f3n.<\/strong><\/p>\n

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Aunque el t\u00e9rmino biopsias l\u00edquidas es relativamente nuevo en el contexto del diagn\u00f3stico molecular de tumores, se ha aceptado ampliamente entre pat\u00f3logos y onc\u00f3logos. En el diagn\u00f3stico de tumores, este t\u00e9rmino se utiliz\u00f3 primero para el an\u00e1lisis de c\u00e9lulas tumorales circulantes (CTC) y s\u00f3lo m\u00e1s tarde para el ADN libre de c\u00e9lulas circulantes (cfADN). En resumen, se trata de un t\u00e9rmino gen\u00e9rico para referirse a la extracci\u00f3n de material de un tumor s\u00f3lido mediante la simple toma de una muestra de sangre. No obstante, el t\u00e9rmino “biopsia l\u00edquida” no se limita exclusivamente a su uso en el diagn\u00f3stico de tumores: En el diagn\u00f3stico prenatal, las muestras de sangre pueden utilizarse para extraer conclusiones sobre las anomal\u00edas cromos\u00f3micas del feto.<\/p>\n

Inter\u00e9s por la detecci\u00f3n m\u00ednimamente invasiva<\/h2>\n

Las c\u00e9lulas tumorales circulantes (CTC) y el ADN libre de c\u00e9lulas circulante (cfADN) se han investigado durante d\u00e9cadas y se han debatido como posibles marcadores de diagn\u00f3stico y pron\u00f3stico en la literatura. La primera descripci\u00f3n del CTC tuvo lugar en el siglo XIX por el australiano J. Ashworth (1869), la del cfADN algo menos de un siglo despu\u00e9s por los dos franceses P. Mandel y P. Metais (1948).<\/p>\n

Las CTC pueden originarse tanto en el tumor primario como en las met\u00e1stasis. A\u00fan no est\u00e1 claro si la liberaci\u00f3n de CTC es un proceso activo y, por tanto, parte de un programa biol\u00f3gico de un tumor, o si la liberaci\u00f3n se produce de forma aleatoria. Sin embargo, se sabe que algunas de estas c\u00e9lulas tienen la capacidad de sobrevivir en el torrente sangu\u00edneo y seguir multiplic\u00e1ndose en otras partes del cuerpo humano. para formar una met\u00e1stasis. Se discute controvertidamente si las c\u00e9lulas individuales son suficientes para ello o si las asociaciones (clusters) de c\u00e9lulas tumorales no son responsables del proceso de met\u00e1stasis a distancia hemat\u00f3gena [1].  <\/p>\n

El ADN circulante libre de c\u00e9lulas (cfADN), en cambio, procede de c\u00e9lulas moribundas (apopt\u00f3ticas o necr\u00f3ticas). El cfADN est\u00e1 formado por ADN procedente tanto de c\u00e9lulas tumorales (ADN tumoral circulante libre de c\u00e9lulas, abreviado ctADN) como de c\u00e9lulas sanas (ADN normal circulante libre de c\u00e9lulas, abreviado cnADN). Es controvertido si el cfADN de la sangre cumple alguna funci\u00f3n. En comparaci\u00f3n con el CTC (1-2,5 horas), el cfADN tiene una semivida relativamente corta de 15-30 minutos.<\/p>\n

Tanto las CTC como el cfADN\/ADNct est\u00e1n adquiriendo una gran importancia para el diagn\u00f3stico de tumores gracias a las nuevas posibilidades de investigaci\u00f3n gen\u00f3mica. Hoy en d\u00eda, la secuenciaci\u00f3n de nueva generaci\u00f3n (NGS) permite secuenciar genomas enteros en muy poco tiempo. Desde el uso de esta tecnolog\u00eda en un gran n\u00famero de ensayos cl\u00ednicos, el n\u00famero de marcadores gen\u00f3micos potencialmente predictivos ha aumentado considerablemente y, en consecuencia, el inter\u00e9s por la detecci\u00f3n m\u00ednimamente invasiva de estos marcadores predictivos en la sangre.<\/p>\n

Determinar las mutaciones de forma significativa<\/h2>\n

En comparaci\u00f3n con la secuenciaci\u00f3n Sanger convencional, la NGS permite secuenciar regiones m\u00e1s amplias simult\u00e1neamente y, sobre todo, con una gran profundidad (redundancia). Esta profundidad es necesaria si se quieren detectar mutaciones subclonales o si el ADN tumoral representa s\u00f3lo una fracci\u00f3n del ADN total que se va a analizar. Este \u00faltimo es el caso del an\u00e1lisis del ctADN: dependiendo de la entidad tumoral y del estadio de la enfermedad tumoral, el contenido de ctADN en la sangre puede variar mucho o ascender hasta unos pocos por mil.<\/p>\n

Con la mayor\u00eda de los secuenciadores NGS, los protocolos est\u00e1ndar pueden detectar mutaciones que s\u00f3lo representan el 2-5% del ADN total. Sin embargo, el ctADN suele estar por debajo de este umbral, especialmente en tumores a\u00fan no avanzados o en pacientes sometidos a terapia. A diferencia de la NGS, la PCR digital permite determinar una mutaci\u00f3n en este rango de alta sensibilidad: con la ayuda de sondas espec\u00edficas marcadas con fluorescencia, se pueden determinar de forma significativa ciertas mutaciones en el rango del 0,01%. El procedimiento y la t\u00e9cnica se describen utilizando el ejemplo de la PCR digital en gotitas (Fig. 1) <\/strong>. La desventaja de este m\u00e9todo es que debe llevarse a cabo una reacci\u00f3n distinta para cada mutaci\u00f3n que se quiera determinar. Por lo tanto, no se recomienda utilizar esta metodolog\u00eda para una investigaci\u00f3n general del genoma, sino s\u00f3lo para la investigaci\u00f3n de mutaciones aisladas.<\/p>\n

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C\u00e9lulas tumorales circulantes (CTC)<\/h2>\n

En la \u00faltima d\u00e9cada, varios estudios han demostrado que la detecci\u00f3n de una mayor cantidad de CTC en la sangre de pacientes con c\u00e1ncer avanzado se asocia a una mala supervivencia [2]. En este contexto, la autoridad reguladora estadounidense FDA ha aprobado la recogida del n\u00famero de CTC para la evaluaci\u00f3n del pron\u00f3stico en pacientes con c\u00e1ncer metast\u00e1sico de pr\u00f3stata, colorrectal y de mama mediante el dispositivo CellSearch\u00ae<\/sup> (Veridex). Se trata del \u00fanico dispositivo aprobado por la FDA para la determinaci\u00f3n de CTC.<\/p>\n

La detecci\u00f3n o el enriquecimiento de c\u00e9lulas tumorales circulantes sigue siendo un reto tecnol\u00f3gico: En 10 ml de sangre total hay unos 50.000 millones de gl\u00f3bulos rojos, 50 millones de gl\u00f3bulos blancos, pero s\u00f3lo entre 0 y 100 CTC. B\u00e1sicamente, existen dos m\u00e9todos t\u00e9cnicos para detectar y registrar CTC en la sangre. Para ello se puede utilizar un enfoque basado en las propiedades biol\u00f3gicas de las CTC, en particular en la expresi\u00f3n de prote\u00ednas que s\u00f3lo se encuentran en las CTC pero no en las c\u00e9lulas sangu\u00edneas. As\u00ed, las CTC pueden capturarse con anticuerpos contra prote\u00ednas espec\u00edficas de las c\u00e9lulas epiteliales como la EpCAM o las citoqueratinas. Otra posibilidad es reconocer las CTC en funci\u00f3n de sus diferentes propiedades f\u00edsicas, como la densidad, el tama\u00f1o o la deformabilidad.<\/p>\n

Diagn\u00f3stico predictivo de tumores con CTC para el futuro<\/h2>\n

En el pasado, los ensayos cl\u00ednicos se centraban en el n\u00famero de CTC y su correlaci\u00f3n con la supervivencia. Gracias a los avances tecnol\u00f3gicos, ahora es posible pescar estas c\u00e9lulas y analizarlas mediante NGS u otras tecnolog\u00edas, como la PCR en tiempo real [3]. Aunque en la actualidad este enfoque se utiliza principalmente en investigaci\u00f3n, existen fundadas esperanzas de que en el futuro puedan realizarse diagn\u00f3sticos tumorales predictivos con estas c\u00e9lulas.<\/p>\n

El ejemplo m\u00e1s prometedor de uso predictivo de CTC hasta la fecha es la determinaci\u00f3n del estado AR-V7 en pacientes con c\u00e1ncer de pr\u00f3stata resistente a la castraci\u00f3n. El AR-V7 es una variante de empalme del gen del receptor de andr\u00f3genos que da lugar a una prote\u00edna alterada que es constitutivamente activa. Antonarakis et al. pudieron demostrar que los pacientes cuyas CTC expresaban el AR-V7 ARN respond\u00edan peor a las terapias con enzalutamida y abiraterona [4]. El ensayo utilizado en este estudio se basa en capturar las CTC mediante anticuerpos y realizar la PCR en tiempo real con cebadores espec\u00edficos AR-V7 sobre el ARNm extra\u00eddo. Esta prueba AR-V7 basada en CTC se comercializar\u00e1 en un futuro pr\u00f3ximo. Podr\u00eda considerarse un hito en el uso de CTC para detectar mutaciones, fusiones de genes y otros marcadores predictivos.<\/p>\n

ADN circulante libre de c\u00e9lulas (cfADN)<\/h2>\n

Mientras que los primeros estudios de cfADN investigaron una posible correlaci\u00f3n de la cantidad de cfADN con el pron\u00f3stico, hoy en d\u00eda la NGS puede utilizarse para determinar la secuencia de bases del cfADN (es decir, el ctADN) procedente de las c\u00e9lulas tumorales. Dado que la diferenciaci\u00f3n entre el cfADN general y el ctADN no es posible por razones t\u00e9cnicas al extraer el cfADN, la mayor parte del cfADN puede consistir en cnADN y no en ctADN. Para poder seguir determinando las mutaciones en el ctADN, debe alcanzarse una gran profundidad con la NGS. Se requiere plasma sangu\u00edneo para las pruebas de cfADN.<\/p>\n

Gracias a la NGS, recientemente ha sido posible detectar las mutaciones del tumor en el ADNct de hasta el 75% de los pacientes con tumores avanzados [5]. En los tumores no avanzados, la tasa de detecci\u00f3n desciende hasta aproximadamente el 50%. Sin embargo, cabe suponer que estos \u00edndices aumentar\u00e1n gracias al uso de m\u00e9todos m\u00e1s sensibles.
\nVarios estudios han demostrado que la cantidad de ctADN se correlaciona con la carga tumoral: si el tumor responde a la terapia, la cantidad de ctADN en la sangre del paciente disminuye. Lo contrario ocurre con la aparici\u00f3n de una recidiva: en un peque\u00f1o grupo de pacientes con c\u00e1ncer de mama, Dawson et al. muestran un aumento de los niveles de ctADN en sangre semanas antes de que el diagn\u00f3stico por imagen est\u00e1ndar pueda detectar la recidiva [6]. Para estos ex\u00e1menes, basta con determinar o cuantificar algunas mutaciones en la sangre espec\u00edficas del tumor correspondiente. Si se quiere utilizar la biopsia l\u00edquida para investigar si el tumor de un paciente tiene una mutaci\u00f3n predictiva, se suelen utilizar los llamados paneles para secuenciaci\u00f3n, que var\u00edan mucho en tama\u00f1o (Fig. 2)<\/strong>.<\/p>\n

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\nLos paneles est\u00e1ndar utilizados en el diagn\u00f3stico de tumores abarcan mutaciones de entre 20 y 50 genes. Estos genes son genes relevantes para la terapia como EGFR, KRAS, NRAS o BRAF. Dado que, como se ha mencionado, para la secuenciaci\u00f3n del cfADN se requieren profundidades de secuenciaci\u00f3n elevadas, los recursos y los costes de secuenciaci\u00f3n aumentan con el tama\u00f1o del panel.<\/p>\n

Debido a la gran relevancia cl\u00ednica de las aplicaciones, los ex\u00e1menes basados en el cfADN est\u00e1n ya muy cerca de la pr\u00e1ctica cl\u00ednica diaria: el departamento de patolog\u00eda del Hospital Universitario de Basilea ofrece an\u00e1lisis de cfADN para el diagn\u00f3stico desde abril de este a\u00f1o. Esto implica el uso de paneles NGS o PCR digital para examinar el cfADN de los pacientes en busca de mutaciones con propiedades predictivas. Esto es de especial inter\u00e9s si una biopsia de tejido no es posible o no es razonable para un paciente. Esta aplicaci\u00f3n se est\u00e1 introduciendo actualmente sobre todo en el diagn\u00f3stico predictivo de los carcinomas de pulm\u00f3n. Sin embargo, es previsible una expansi\u00f3n a otras entidades tumorales.
\nMediante los ex\u00e1menes de cfADN pueden determinarse de forma no invasiva las mutaciones del EGFR conocidas y relevantes para la terapia, en particular tambi\u00e9n la mutaci\u00f3n T790M del EGFR, que es predictiva de la respuesta al osimertinib en pacientes con resistencia a los inhibidores de la tirosina quinasa del EGFR (EGFR-TKI).<\/p>\n

Un caso pr\u00e1ctico<\/h2>\n

Hace tres a\u00f1os, se detect\u00f3 una mutaci\u00f3n en el gen EGFR (p.E746-T751delinsF) en un paciente con un adenocarcinoma de pulm\u00f3n TTF1-positivo en estadio IV mediante la secuenciaci\u00f3n de c\u00e9lulas tumorales procedentes de un lavado broncoalveolar. La paciente fue entonces tratada con el EGFR TKI erlotinib durante ocho meses y posteriormente, como terapia de segunda l\u00ednea, con afatinib (Fig. 3)<\/strong>.<\/p>\n

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\nLa secuenciaci\u00f3n de una biopsia de tejido revel\u00f3 una mutaci\u00f3n KRAS (p.G13D) sugestiva de resistencia a los EGFR-TKI. La paciente fue cambiada a quimioterapia de corta duraci\u00f3n debido a los graves efectos secundarios de los TKI del EGFR, seguida de tratamiento con el inhibidor de la PD 1 nivolumab. El diagn\u00f3stico por imagen mostr\u00f3 progresi\u00f3n tumoral en ese momento. Debido a la inaccesibilidad del tumor, se realiz\u00f3 una biopsia l\u00edquida: Adem\u00e1s de la mutaci\u00f3n original del EGFR, se detectaron de nuevo una mutaci\u00f3n TP53 y una mutaci\u00f3n EGFR T790M. Este \u00faltimo es predictivo de la respuesta al osimertinib. La paciente fue tratada con osimertinib y mostr\u00f3 una respuesta parcial en la tomograf\u00eda computarizada dos meses despu\u00e9s de iniciar la terapia.<\/p>\n

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Literatura:<\/p>\n

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  1. Cheung KJ, et al.:  Una ruta colectiva hacia la met\u00e1stasis: la siembra por grupos de c\u00e9lulas tumorales. Science 2016 abr 8; 352(6282): 167-169.<\/li>\n
  2. De Bono JS, et al: Las c\u00e9lulas tumorales circulantes predicen el beneficio de supervivencia del tratamiento en el c\u00e1ncer de pr\u00f3stata metast\u00e1sico resistente a la castraci\u00f3n. Clin Cancer Res 2008 Oct 1; 14(19): 6302-6309.<\/li>\n
  3. Lohr JG, et al: La secuenciaci\u00f3n del exoma completo de las c\u00e9lulas tumorales circulantes proporciona una ventana al c\u00e1ncer de pr\u00f3stata metast\u00e1sico. Nat Biotechnol 2014 mayo; 32(5): 479-484.<\/li>\n
  4. Antonarakis ES, et al: AR-V7 y resistencia a la enzalutamida y la abiraterona en el c\u00e1ncer de pr\u00f3stata. N Engl J Med 2014 Sep 11; 371(11): 1028-1038.  <\/li>\n
  5. Bettegowda C, et al: Detecci\u00f3n de ADN tumoral circulante en neoplasias humanas en fase temprana y tard\u00eda. Sci Transl Med 2014 Feb 19; 6(224): 224ra24.<\/li>\n
  6. Dawson SJ, et al: An\u00e1lisis del ADN tumoral circulante para monitorizar el c\u00e1ncer de mama metast\u00e1sico. N Engl J Med 2013 Mar 28; 368(13): 1199-1209.<\/li>\n<\/ol>\n

    \nInFo ONCOLOG\u00cdA Y HEMATOLOG\u00cdA 2016; 4(4): 10-13<\/em><\/p>\n

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