{"id":341201,"date":"2016-07-20T02:00:00","date_gmt":"2016-07-20T00:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/medizinonline.com\/une-nouvelle-dimension-pour-lanalyse-predictive-non-invasive-des-marqueurs-tumoraux\/"},"modified":"2016-07-20T02:00:00","modified_gmt":"2016-07-20T00:00:00","slug":"une-nouvelle-dimension-pour-lanalyse-predictive-non-invasive-des-marqueurs-tumoraux","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/medizinonline.com\/fr\/une-nouvelle-dimension-pour-lanalyse-predictive-non-invasive-des-marqueurs-tumoraux\/","title":{"rendered":"Une nouvelle dimension pour l’analyse pr\u00e9dictive non invasive des marqueurs tumoraux"},"content":{"rendered":"

Dans le domaine du diagnostic des tumeurs, le terme de biopsies liquides d\u00e9signe l’analyse de l’ADN acellulaire circulant (cfDNA) et des cellules tumorales circulantes. De nos jours, il est possible de d\u00e9tecter les mutations d’une tumeur de mani\u00e8re peu invasive gr\u00e2ce \u00e0 l’analyse du cfDNA dans les tumeurs avanc\u00e9es. Pour les analyses cfDNA, il convient d’utiliser du plasma et non du s\u00e9rum. Les cellules tumorales circulantes pourront \u00eatre utilis\u00e9es dans un avenir proche pour l’analyse pr\u00e9dictive des marqueurs, comme par exemple pour d\u00e9terminer le variant d’\u00e9pissage AR-V7 dans le cancer de la prostate r\u00e9sistant \u00e0 la castration.<\/strong><\/p>\n

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Bien que le terme de “biopsies liquides” soit relativement nouveau dans le contexte du diagnostic mol\u00e9culaire des tumeurs, il est largement entr\u00e9 dans les m\u0153urs des pathologistes et des oncologues. Dans le diagnostic des tumeurs, ce terme a d’abord \u00e9t\u00e9 utilis\u00e9 pour l’analyse des cellules tumorales circulantes (“circulating tumor cells”, CTC) et plus tard seulement pour celle de l’ADN libre de cellules circulantes (“circulating cell free DNA”, cfDNA). En r\u00e9sum\u00e9, il s’agit d’un terme g\u00e9n\u00e9rique d\u00e9signant le pr\u00e9l\u00e8vement de mat\u00e9riel sur une tumeur solide par simple pr\u00e9l\u00e8vement d’un \u00e9chantillon de sang. N\u00e9anmoins, le terme “biopsie liquide” ne se limite pas exclusivement \u00e0 l’utilisation dans le diagnostic des tumeurs : Dans le diagnostic pr\u00e9natal, les pr\u00e9l\u00e8vements sanguins permettent de d\u00e9tecter des anomalies chromosomiques chez le f\u0153tus.<\/p>\n

Int\u00e9r\u00eat pour la d\u00e9tection peu invasive<\/h2>\n

Les cellules tumorales circulantes (CTC) et l’ADN acellulaire circulant (cfDNA) sont \u00e9tudi\u00e9s depuis des d\u00e9cennies et font l’objet de discussions dans la litt\u00e9rature en tant que marqueurs diagnostiques et pronostiques potentiels. La premi\u00e8re description de la CTC a eu lieu au 19e si\u00e8cle par l’Australien J. Ashworth (1869), celle de l’ADNcf un peu moins d’un si\u00e8cle plus tard par les deux Fran\u00e7ais P. Mandel et P. Metais (1948).<\/p>\n

Les CTC peuvent provenir \u00e0 la fois de la tumeur primaire et des m\u00e9tastases. Il n’est pas encore clairement \u00e9tabli si la lib\u00e9ration de CTC est un processus actif et fait donc partie d’un programme biologique d’une tumeur, ou si la lib\u00e9ration est al\u00e9atoire. En revanche, on sait qu’une partie de ces cellules a la capacit\u00e9 de survivre dans la circulation sanguine et de se reproduire ou de se multiplier \u00e0 un autre endroit du corps humain. de former une m\u00e9tastase. La question de savoir si des cellules individuelles suffisent pour cela ou si ce ne sont pas des groupes de cellules tumorales qui sont responsables du processus de m\u00e9tastases h\u00e9matog\u00e8nes \u00e0 distance est controvers\u00e9e [1].  <\/p>\n

En revanche, l’ADN acellulaire circulant (cfDNA) provient de cellules qui meurent (apoptotiques ou n\u00e9crotiques). L’ADNcf se compose \u00e0 la fois d’ADN provenant de cellules tumorales (ADN tumoral circulant sans cellules, abr\u00e9g\u00e9 en ADNct) et de cellules saines (ADN normal circulant sans cellules, abr\u00e9g\u00e9 en ADNcn). La question de savoir si l’ADNcf exerce une fonction dans le sang est controvers\u00e9e. Compar\u00e9 aux CTC (1-2,5 heures), le cfDNA dispose d’une demi-vie relativement courte de 15-30 minutes.<\/p>\n

Tant le CTC que le cfDNA\/ctDNA gagnent fortement en importance pour le diagnostic des tumeurs gr\u00e2ce aux nouvelles possibilit\u00e9s d’analyses g\u00e9nomiques. Le s\u00e9quen\u00e7age de nouvelle g\u00e9n\u00e9ration (NGS) permet aujourd’hui de s\u00e9quencer des g\u00e9nomes entiers dans un d\u00e9lai tr\u00e8s court. Depuis l’utilisation de cette technologie dans un grand nombre d’\u00e9tudes cliniques, le nombre de marqueurs g\u00e9nomiques potentiellement pr\u00e9dictifs a fortement augment\u00e9 et, par cons\u00e9quent, l’int\u00e9r\u00eat pour une d\u00e9tection peu invasive de ces marqueurs pr\u00e9dictifs dans le sang a \u00e9galement augment\u00e9.<\/p>\n

D\u00e9terminer les mutations de mani\u00e8re significative<\/h2>\n

Par rapport au s\u00e9quen\u00e7age Sanger conventionnel, le NGS permet de s\u00e9quencer de plus grandes r\u00e9gions simultan\u00e9ment et surtout avec une grande profondeur (redondance). Cette profondeur est n\u00e9cessaire si l’on veut d\u00e9tecter des mutations sous-clonales ou si l’ADN tumoral ne repr\u00e9sente qu’une fraction de l’ADN total \u00e0 analyser. C’est le cas de l’analyse de l’ADNc : en fonction de l’entit\u00e9 tumorale et du stade de la maladie tumorale, la proportion d’ADNc dans le sang peut varier consid\u00e9rablement, voire atteindre quelques pour mille.<\/p>\n

Avec la plupart des appareils de s\u00e9quen\u00e7age NGS, les protocoles standard permettent de d\u00e9tecter des mutations qui ne repr\u00e9sentent que 2 \u00e0 5 % de l’ADN total. Cependant, l’ADNc est souvent inf\u00e9rieur \u00e0 ce seuil, en particulier dans les tumeurs non encore avanc\u00e9es ou chez les patients sous traitement. Contrairement au NGS, la PCR num\u00e9rique permet de d\u00e9terminer une mutation dans cette zone tr\u00e8s sensible : \u00e0 l’aide de sondes sp\u00e9cifiques marqu\u00e9es \u00e0 la fluorescence, certaines mutations peuvent \u00eatre d\u00e9termin\u00e9es de mani\u00e8re significative dans une plage de 0,01%. La proc\u00e9dure et la technique sont d\u00e9crites \u00e0 l’aide de l’exemple de la PCR num\u00e9rique en gouttelettes (fig. 1). <\/strong>L’inconv\u00e9nient de cette m\u00e9thode est qu’il faut effectuer une r\u00e9action distincte pour chaque mutation \u00e0 d\u00e9terminer. Il n’est donc pas recommand\u00e9 d’utiliser cette m\u00e9thodologie pour une \u00e9tude g\u00e9n\u00e9rale du g\u00e9nome, mais uniquement pour l’\u00e9tude de mutations individuelles.<\/p>\n

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Cellules tumorales circulantes (CTC)<\/h2>\n

Au cours de la derni\u00e8re d\u00e9cennie, de nombreuses \u00e9tudes ont montr\u00e9 que la d\u00e9tection d’une plus grande quantit\u00e9 de CTC dans le sang des patients atteints d’un cancer avanc\u00e9 \u00e9tait associ\u00e9e \u00e0 une mauvaise survie [2]. Dans ce contexte, la FDA am\u00e9ricaine a approuv\u00e9 le relev\u00e9 du nombre de CTC pour l’\u00e9valuation du pronostic chez les patients atteints de cancers m\u00e9tastas\u00e9s de la prostate, du c\u00f4lon-rectum et du sein \u00e0 l’aide du dispositif CellSearch\u00ae<\/sup> (Veridex). Il s’agit du seul appareil approuv\u00e9 par la FDA pour la d\u00e9termination de la CTC.<\/p>\n

La d\u00e9tection ou l’enrichissement des cellules tumorales circulantes reste un d\u00e9fi technologique : Dans 10 ml de sang total, il y a environ 50 milliards de globules rouges, 50 millions de globules blancs, mais seulement entre 0 et 100 CTC. En principe, il existe deux m\u00e9thodes techniques pour d\u00e9tecter et enregistrer les CTC dans le sang. On peut utiliser pour cela une approche bas\u00e9e sur les propri\u00e9t\u00e9s biologiques des CTC, notamment sur l’expression de prot\u00e9ines pr\u00e9sentes uniquement dans les CTC, mais pas dans les cellules sanguines. Ainsi, les CTC peuvent \u00eatre captur\u00e9s par des anticorps dirig\u00e9s contre des prot\u00e9ines sp\u00e9cifiques des cellules \u00e9pith\u00e9liales, telles que l’EpCAM ou les cytok\u00e9ratines. Une autre possibilit\u00e9 est de reconna\u00eetre les CTC en fonction de leurs diff\u00e9rentes caract\u00e9ristiques physiques, telles que la densit\u00e9, la taille ou la d\u00e9formabilit\u00e9.<\/p>\n

Diagnostic pr\u00e9dictif des tumeurs CTC pour l’avenir<\/h2>\n

Dans le pass\u00e9, les essais cliniques se sont concentr\u00e9s sur le nombre de CTC et la corr\u00e9lation avec la survie. Gr\u00e2ce aux progr\u00e8s technologiques, il est aujourd’hui possible d’extraire ces cellules et de les analyser \u00e0 l’aide du NGS ou d’autres technologies, comme la PCR en temps r\u00e9el [3]. Bien que cette approche soit actuellement principalement utilis\u00e9e dans le cadre de la recherche, il existe des espoirs l\u00e9gitimes de pouvoir effectuer \u00e0 l’avenir des diagnostics pr\u00e9dictifs de tumeurs sur ces cellules.<\/p>\n

L’exemple le plus prometteur \u00e0 ce jour d’une application pr\u00e9dictive de la CTC est la d\u00e9termination du statut AR-V7 chez les patients atteints d’un cancer de la prostate r\u00e9sistant \u00e0 la castration. AR-V7 est une variante d’\u00e9pissage du g\u00e8ne du r\u00e9cepteur des androg\u00e8nes, qui conduit \u00e0 une prot\u00e9ine modifi\u00e9e qui est constitutivement active. Antonarakis et al. ont montr\u00e9 que les patients dont les CTC exprimaient l’AR-V7 r\u00e9pondaient moins bien aux traitements par enzalutamide et abirat\u00e9rone [4]. Le test utilis\u00e9 dans cette \u00e9tude est bas\u00e9 sur la capture des CTC \u00e0 l’aide d’anticorps et la r\u00e9alisation d’une PCR en temps r\u00e9el avec des amorces AR-V7 sp\u00e9cifiques sur l’ARNm extrait. Ce test AR-V7 bas\u00e9 sur CTC sera commercialis\u00e9 dans un avenir proche. Il pourrait \u00eatre consid\u00e9r\u00e9 comme une \u00e9tape importante dans l’utilisation de la CTC pour d\u00e9tecter les mutations, les fusions de g\u00e8nes et d’autres marqueurs pr\u00e9dictifs.<\/p>\n

ADN acellulaire circulant (cfDNA)<\/h2>\n

Alors que les premi\u00e8res \u00e9tudes sur le cfDNA ont examin\u00e9 une \u00e9ventuelle corr\u00e9lation entre la quantit\u00e9 de cfDNA et le pronostic, il est aujourd’hui possible d’utiliser le NGS pour d\u00e9terminer la s\u00e9quence de bases du cfDNA (c.-\u00e0-d. le ctDNA) issu des cellules tumorales. Comme il n’est pas possible, pour des raisons techniques, de faire la diff\u00e9rence entre l’ADNc g\u00e9n\u00e9ral et l’ADNtc lors de l’extraction de l’ADNc, il se peut que la majeure partie de l’ADNc soit constitu\u00e9e d’ADNcn et non d’ADNtc. Pour pouvoir n\u00e9anmoins d\u00e9terminer les mutations dans l’ADNc, le NGS doit atteindre une grande profondeur. Pour les \u00e9tudes sur l’ADNcf, le plasma sanguin est n\u00e9cessaire.<\/p>\n

Le NGS a r\u00e9cemment permis de d\u00e9tecter les mutations de la tumeur dans l’ADNc chez jusqu’\u00e0 75% des patients atteints de tumeurs avanc\u00e9es [5]. Pour les tumeurs non avanc\u00e9es, le taux de d\u00e9tection tombe \u00e0 environ 50%. On peut toutefois s’attendre \u00e0 ce que ces taux augmentent gr\u00e2ce \u00e0 l’utilisation de m\u00e9thodes plus sensibles.
\nPlusieurs \u00e9tudes ont montr\u00e9 que la quantit\u00e9 d’ADNc est corr\u00e9l\u00e9e \u00e0 la charge tumorale : si la tumeur r\u00e9pond au traitement, la quantit\u00e9 d’ADNc dans le sang du patient diminue. L’inverse se produit lors de la survenue d’une r\u00e9cidive : sur un petit collectif de patientes atteintes d’un cancer du sein, Dawson et al. montrer une augmentation des taux d’ADNc dans le sang des semaines avant que l’imagerie standard ne puisse d\u00e9tecter la r\u00e9cidive [6]. Pour ces examens, il suffit de d\u00e9terminer ou de quantifier dans le sang quelques mutations sp\u00e9cifiques \u00e0 la tumeur en question. Si l’on souhaite utiliser la biopsie liquide pour d\u00e9terminer si la tumeur d’un patient pr\u00e9sente une mutation pr\u00e9dictive, on utilise g\u00e9n\u00e9ralement pour le s\u00e9quen\u00e7age ce que l’on appelle des panels, dont la taille varie fortement (fig. 2).<\/strong><\/p>\n

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\nLes panels utilis\u00e9s de mani\u00e8re standard dans le diagnostic des tumeurs couvrent des mutations entre 20 et 50 g\u00e8nes. Ces g\u00e8nes sont des g\u00e8nes pertinents pour la th\u00e9rapie, tels que EGFR, KRAS, NRAS ou BRAF. Comme nous l’avons dit, le s\u00e9quen\u00e7age de l’ADNc n\u00e9cessite des profondeurs de s\u00e9quen\u00e7age \u00e9lev\u00e9es, les ressources et les co\u00fbts de s\u00e9quen\u00e7age augmentent avec la taille du panel.<\/p>\n

En raison de la grande pertinence clinique des applications, les analyses bas\u00e9es sur le cfDNA sont d\u00e9sormais tr\u00e8s proches de la pratique clinique quotidienne : le service de pathologie de l’H\u00f4pital universitaire de B\u00e2le propose depuis avril de cette ann\u00e9e l’analyse du cfDNA pour le diagnostic. Il s’agit d’analyser l’ADNcf des patients \u00e0 l’aide de panels NGS ou de PCR num\u00e9rique afin de d\u00e9tecter les mutations ayant des propri\u00e9t\u00e9s pr\u00e9dictives. Ceci est particuli\u00e8rement int\u00e9ressant dans le cas o\u00f9 une biopsie tissulaire n’est pas possible ou raisonnablement possible chez un patient. Cette application est actuellement introduite principalement dans le diagnostic pr\u00e9dictif du cancer du poumon. Une extension \u00e0 d’autres entit\u00e9s tumorales est toutefois pr\u00e9visible.
\nLes analyses cfDNA permettent de d\u00e9terminer de mani\u00e8re non invasive les mutations EGFR connues et pertinentes pour le traitement, en particulier la mutation EGFR T790M, qui est pr\u00e9dictive de la r\u00e9ponse \u00e0 l’osimertinib chez les patients r\u00e9sistants aux inhibiteurs de la tyrosine kinase de l’EGFR (ITK-EGFR).<\/p>\n

Un cas pratique<\/h2>\n

Une mutation du g\u00e8ne EGFR (p.E746-T751delinsF) a \u00e9t\u00e9 d\u00e9tect\u00e9e il y a trois ans par s\u00e9quen\u00e7age de cellules tumorales issues d’un lavage broncho-alv\u00e9olaire chez une patiente atteinte d’un ad\u00e9nocarcinome pulmonaire de stade IV positif pour le TTF1. La patiente a ensuite \u00e9t\u00e9 trait\u00e9e pendant huit mois par l’erlotinib, un EGFR-TKI, puis, en deuxi\u00e8me intention, par l’afatinib (fig. 3).<\/strong><\/p>\n

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\nLe s\u00e9quen\u00e7age d’une biopsie tissulaire a r\u00e9v\u00e9l\u00e9 une mutation KRAS (p.G13D) qui sugg\u00e8re une r\u00e9sistance \u00e0 l’EGFR-TKI. La patiente est pass\u00e9e \u00e0 une chimioth\u00e9rapie de courte dur\u00e9e, suivie d’un traitement par nivolumab, un inhibiteur de PD 1, en raison d’effets secondaires importants de l’EGFR-TKI. L’imagerie montrait \u00e0 ce moment-l\u00e0 une progression de la tumeur. En raison de l’inaccessibilit\u00e9 de la tumeur, une biopsie liquide a \u00e9t\u00e9 r\u00e9alis\u00e9e : En plus de la mutation EGFR initiale, une nouvelle mutation TP53 et une mutation EGFR T790M ont \u00e9t\u00e9 d\u00e9tect\u00e9es. Cette derni\u00e8re est pr\u00e9dictive de la r\u00e9ponse \u00e0 l’osimertinib. La patiente a \u00e9t\u00e9 trait\u00e9e par osimertinib et a pr\u00e9sent\u00e9 une r\u00e9ponse partielle \u00e0 la tomodensitom\u00e9trie deux mois apr\u00e8s le d\u00e9but du traitement.<\/p>\n

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Litt\u00e9rature :<\/p>\n

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  1. Cheung KJ, et al. :  A collective route to metastasis : Seeding by tumor cell clusters. Science 2016 Avril 8 ; 352(6282) : 167-169.<\/li>\n
  2. De Bono JS, et al : Les cellules tumorales circulantes pr\u00e9disent le b\u00e9n\u00e9fice en termes de survie du traitement du cancer de la prostate m\u00e9tastatique r\u00e9sistant \u00e0 la castration. Clin Cancer Res 2008 Oct 1 ; 14(19) : 6302-6309.<\/li>\n
  3. Lohr JG, et al : Whole-exome sequencing of circulating tumor cells provides a window into metastatic prostate cancer. Nat Biotechnol 2014 May ; 32(5) : 479-484.<\/li>\n
  4. Antonarakis ES, et al : AR-V7 et r\u00e9sistance \u00e0 l’enzalutamide et \u00e0 l’abiraterone dans le cancer de la prostate. N Engl J Med 2014 Sep 11 ; 371(11) : 1028-1038.  <\/li>\n
  5. Bettegowda C, et al : D\u00e9tection de l’ADN tumoral circulant dans les tumeurs humaines pr\u00e9coces et tardives. Sci Transl Med 2014 Feb 19 ; 6(224) : 224ra24.<\/li>\n
  6. Dawson SJ, et al : Analyse de l’ADN tumoral circulant pour surveiller le cancer du sein m\u00e9tastatique. N Engl J Med 2013 Mar 28 ; 368(13) : 1199-1209.<\/li>\n<\/ol>\n

    \nInFo ONKOLOGIE & H\u00c9MATOLOGIE 2016 ; 4(4) : 10-13<\/em><\/p>\n

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