{"id":341212,"date":"2016-07-20T02:00:00","date_gmt":"2016-07-20T00:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/medizinonline.com\/nuova-dimensione-dellanalisi-predittiva-non-invasiva-dei-marcatori-nei-tumori\/"},"modified":"2016-07-20T02:00:00","modified_gmt":"2016-07-20T00:00:00","slug":"nuova-dimensione-dellanalisi-predittiva-non-invasiva-dei-marcatori-nei-tumori","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/medizinonline.com\/it\/nuova-dimensione-dellanalisi-predittiva-non-invasiva-dei-marcatori-nei-tumori\/","title":{"rendered":"Nuova dimensione dell’analisi predittiva non invasiva dei marcatori nei tumori"},"content":{"rendered":"

Nella diagnostica tumorale, il termine biopsie liquide si riferisce all’analisi del DNA libero da cellule circolanti (cfDNA) e delle cellule tumorali circolanti. Oggi \u00e8 possibile rilevare le mutazioni di un tumore in fase avanzata in modo minimamente invasivo, utilizzando le analisi del cfDNA. Il plasma, non il siero, deve essere utilizzato per il test del cfDNA. Le cellule tumorali circolanti potranno essere utilizzate per l’analisi dei marcatori predittivi nel prossimo futuro, come ad esempio per la determinazione della variante di splicing AR-V7 nel carcinoma prostatico resistente alla castrazione.<\/strong><\/p>\n

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Sebbene il termine biopsie liquide sia relativamente nuovo nel contesto della diagnostica molecolare dei tumori, \u00e8 diventato ampiamente accettato dai patologi e dagli oncologi. Nella diagnostica tumorale, questo termine \u00e8 stato utilizzato inizialmente per l’analisi delle cellule tumorali circolanti (CTC) e solo successivamente per il DNA libero da cellule circolanti (cfDNA). In sintesi, si tratta di un termine generico per indicare il prelievo di materiale da un tumore solido mediante un semplice prelievo di sangue. Tuttavia, il termine “biopsia liquida” non \u00e8 limitato esclusivamente all’uso nella diagnostica tumorale: Nella diagnostica prenatale, i campioni di sangue possono essere utilizzati per trarre conclusioni sulle anomalie cromosomiche del feto.<\/p>\n

Interesse per la diagnosi minimamente invasiva<\/h2>\n

Le cellule tumorali circolanti (CTC) e il DNA libero da cellule circolanti (cfDNA) sono stati studiati per decenni e discussi in letteratura come possibili marcatori diagnostici e prognostici. La prima descrizione della CTC avvenne nel XIX secolo ad opera dell’australiano J. Ashworth (1869), quella del cfDNA poco meno di un secolo dopo ad opera dei due francesi P. Mandel e P. Metais (1948).<\/p>\n

Le CTC possono provenire dal tumore primario e dalle metastasi. Non \u00e8 ancora chiaro se il rilascio di CTC sia un processo attivo e quindi parte di un programma biologico di un tumore, o se il rilascio avvenga in modo casuale. Tuttavia, \u00e8 noto che alcune di queste cellule hanno la capacit\u00e0 di sopravvivere nel flusso sanguigno e di continuare a moltiplicarsi in altre parti del corpo umano. per formare una metastasi. \u00c8 controverso se siano sufficienti singole cellule per questo o se le associazioni (cluster) di cellule tumorali non siano responsabili del processo di metastasi ematogena a distanza [1].  <\/p>\n

Il DNA libero da cellule circolanti (cfDNA), invece, proviene da cellule morenti (apoptotiche o necrotiche). Il cfDNA \u00e8 costituito dal DNA delle cellule tumorali (DNA tumorale libero da cellule circolanti, abbreviato ctDNA) e delle cellule sane (DNA normale libero da cellule circolanti, abbreviato cnDNA). \u00c8 controverso se il cfDNA nel sangue svolga una funzione. Rispetto alla CTC (1-2,5 ore), il cfDNA ha un’emivita relativamente breve di 15-30 minuti.<\/p>\n

Sia le CTC che il cfDNA\/ctDNA stanno acquisendo grande importanza per la diagnostica dei tumori, grazie alle nuove possibilit\u00e0 di indagini genomiche. Oggi, il sequenziamento di nuova generazione (NGS) consente di sequenziare interi genomi in tempi molto brevi. Dopo l’uso di questa tecnologia in un gran numero di studi clinici, il numero di marcatori genomici potenzialmente predittivi \u00e8 aumentato notevolmente e di conseguenza l’interesse per il rilevamento minimamente invasivo di questi marcatori predittivi nel sangue.<\/p>\n

Determinare le mutazioni in modo significativo<\/h2>\n

Rispetto al sequenziamento Sanger convenzionale, l’NGS consente di sequenziare simultaneamente regioni pi\u00f9 ampie e soprattutto con una profondit\u00e0 elevata (ridondanza). Questa profondit\u00e0 \u00e8 necessaria se si vogliono rilevare mutazioni subclonali o se il DNA tumorale rappresenta solo una frazione del DNA totale da analizzare. Quest’ultimo \u00e8 il caso dell’analisi del ctDNA: a seconda dell’entit\u00e0 del tumore e dello stadio della malattia tumorale, il contenuto di ctDNA nel sangue pu\u00f2 variare notevolmente o ammontare fino a pochi per mille.<\/p>\n

Con la maggior parte dei sequenziatori NGS, i protocolli standard possono rilevare mutazioni che rappresentano solo il 2-5% del DNA totale. Tuttavia, il ctDNA \u00e8 spesso inferiore a questa soglia, soprattutto nei tumori non ancora avanzati o nei pazienti in terapia. A differenza della NGS, la PCR digitale permette di determinare una mutazione in questo intervallo altamente sensibile: con l’aiuto di sonde specifiche marcate con fluorescenza, alcune mutazioni possono essere determinate in modo significativo nell’intervallo dello 0,01%. La procedura e la tecnica sono descritte con l’esempio della PCR digitale a gocce (Fig. 1). <\/strong>Lo svantaggio di questo metodo \u00e8 che deve essere effettuata una reazione separata per ogni mutazione da determinare. Pertanto, non \u00e8 consigliabile utilizzare questa metodologia per un’indagine generale del genoma, ma solo per l’indagine di singole mutazioni.<\/p>\n

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Cellule tumorali circolanti (CTC)<\/h2>\n

Nell’ultimo decennio, ci sono stati diversi studi che hanno dimostrato che il rilevamento di una maggiore quantit\u00e0 di CTC nel sangue dei pazienti con cancro avanzato \u00e8 associato a una scarsa sopravvivenza [2]. In questo contesto, l’autorit\u00e0 regolatoria americana FDA ha approvato la raccolta del numero di CTC per la valutazione della prognosi nei pazienti con tumore metastatico della prostata, del colon-retto e del seno, utilizzando il dispositivo CellSearch\u00ae<\/sup> (Veridex). Questo \u00e8 l’unico dispositivo approvato dalla FDA per la determinazione delle CTC.<\/p>\n

Il rilevamento o l’arricchimento delle cellule tumorali circolanti rimane una sfida tecnologica: In 10 ml di sangue intero ci sono circa 50 miliardi di globuli rossi, 50 milioni di globuli bianchi, ma solo tra 0 e 100 CTC. Fondamentalmente, esistono due metodi tecnici per rilevare e registrare le CTC nel sangue. A tal fine, si pu\u00f2 utilizzare un approccio che si basa sulle propriet\u00e0 biologiche delle CTC, in particolare sull’espressione di proteine che si trovano solo nelle CTC ma non nelle cellule del sangue. Quindi, le CTC possono essere catturate con anticorpi contro proteine specifiche delle cellule epiteliali, come EpCAM o citocheratine. Un’altra possibilit\u00e0 \u00e8 quella di riconoscere le CTC in base alle loro diverse propriet\u00e0 fisiche, come la densit\u00e0, le dimensioni o la deformabilit\u00e0.<\/p>\n

Diagnosi predittiva dei tumori CTC per il futuro<\/h2>\n

In passato, gli studi clinici si sono concentrati sul numero di CTC e sulla correlazione con la sopravvivenza. Grazie ai progressi tecnologici, oggi \u00e8 possibile pescare queste cellule e analizzarle utilizzando l’NGS o altre tecnologie, come la PCR in tempo reale [3]. Sebbene questo approccio sia attualmente utilizzato principalmente nella ricerca, ci sono speranze fondate che in futuro si possa eseguire una diagnostica predittiva del tumore su queste cellule.<\/p>\n

L’esempio pi\u00f9 promettente di uso predittivo delle CTC, ad oggi, \u00e8 la determinazione dello stato di AR-V7 nei pazienti con cancro alla prostata resistente alla castrazione. AR-V7 \u00e8 una variante di splicing del gene del recettore degli androgeni che porta a una proteina alterata che \u00e8 costitutivamente attiva. Antonarakis et al. hanno potuto dimostrare che i pazienti le cui CTC esprimevano l’RNA AR-V7 rispondevano peggio alle terapie con enzalutamide e abiraterone [4]. Il test utilizzato in questo studio si basa sulla cattura delle CTC mediante anticorpi e sull’esecuzione della PCR in tempo reale con primer specifici per AR-V7 sull’mRNA estratto. Questo test AR-V7 basato sulle CTC sar\u00e0 commercializzato nel prossimo futuro. Potrebbe essere considerata una pietra miliare per l’uso delle CTC per rilevare mutazioni, fusioni geniche e altri marcatori predittivi.<\/p>\n

DNA libero da cellule circolanti (cfDNA)<\/h2>\n

Mentre i primi studi sul cfDNA hanno studiato una possibile correlazione tra la quantit\u00e0 di cfDNA e la prognosi, oggi la NGS pu\u00f2 essere utilizzata per determinare la sequenza di basi del cfDNA (cio\u00e8 il ctDNA) proveniente dalle cellule tumorali. Poich\u00e9 la differenziazione tra cfDNA generale e ctDNA non \u00e8 possibile per motivi tecnici quando si estrae il cfDNA, la maggior parte del cfDNA pu\u00f2 essere costituita da cnDNA e non da ctDNA. Tuttavia, per determinare le mutazioni nel ctDNA, \u00e8 necessario raggiungere un’elevata profondit\u00e0 con la NGS. Per il test del cfDNA \u00e8 necessario il plasma sanguigno.<\/p>\n

Utilizzando la NGS, recentemente \u00e8 stato possibile rilevare le mutazioni del tumore nel ctDNA di fino al 75% dei pazienti con tumori avanzati [5]. Nei tumori non avanzati, il tasso di rilevamento scende a circa il 50%. Tuttavia, si pu\u00f2 ipotizzare che questi tassi aumenteranno grazie all’uso di metodi pi\u00f9 sensibili.
\nDiversi studi hanno dimostrato che la quantit\u00e0 di ctDNA \u00e8 correlata al carico tumorale: se il tumore risponde alla terapia, la quantit\u00e0 di ctDNA nel sangue del paziente diminuisce. Il contrario \u00e8 vero per il verificarsi di una recidiva: in un piccolo gruppo di pazienti con cancro al seno, Dawson et al. mostrano un aumento dei livelli di ctDNA nel sangue settimane prima che la diagnostica per immagini standard possa rilevare la recidiva [6]. Per questi esami, \u00e8 sufficiente determinare o quantificare alcune mutazioni nel sangue specifiche del tumore corrispondente. Se si vuole utilizzare la biopsia liquida per indagare se il tumore di un paziente presenta una mutazione predittiva, di solito si utilizzano i cosiddetti pannelli per il sequenziamento, che variano molto in termini di dimensioni (Fig. 2)<\/strong>.<\/p>\n

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\nI pannelli standard utilizzati nella diagnostica dei tumori coprono le mutazioni di 20-50 geni. Questi geni sono geni rilevanti per la terapia, come EGFR, KRAS, NRAS o BRAF. Poich\u00e9, come detto, per il sequenziamento del cfDNA sono necessarie profondit\u00e0 di sequenziamento elevate, le risorse e i costi di sequenziamento aumentano con le dimensioni del pannello.<\/p>\n

Grazie all’elevata rilevanza clinica delle applicazioni, gli esami basati sul cfDNA sono gi\u00e0 molto vicini alla pratica clinica quotidiana: il reparto di patologia dell’Ospedale Universitario di Basilea offre analisi del cfDNA per la diagnostica dall’aprile di quest’anno. In questo processo, il cfDNA dei pazienti viene analizzato per le mutazioni con propriet\u00e0 predittive utilizzando pannelli NGS o la PCR digitale. Questo \u00e8 di particolare interesse se una biopsia tissutale non \u00e8 possibile o non \u00e8 ragionevole per un paziente. Questa applicazione viene attualmente introdotta soprattutto nella diagnosi predittiva dei carcinomi polmonari. Tuttavia, \u00e8 prevedibile un’espansione ad altre entit\u00e0 tumorali.
\nMediante esami del cfDNA, \u00e8 possibile determinare in modo non invasivo le mutazioni EGFR note e rilevanti per la terapia, in particolare anche la mutazione EGFR T790M, che \u00e8 predittiva della risposta a osimertinib nei pazienti con resistenza agli inibitori della tirosin-chinasi EGFR (EGFR-TKI).<\/p>\n

Un caso pratico<\/h2>\n

Tre anni fa, \u00e8 stata rilevata una mutazione nel gene EGFR (p.E746-T751delinsF) in un paziente con un adenocarcinoma del polmone TTF1-positivo, in stadio IV, mediante il sequenziamento delle cellule tumorali di un lavaggio broncoalveolare. Il paziente \u00e8 stato poi trattato con l’EGFR TKI erlotinib per otto mesi e successivamente, come terapia di seconda linea, con afatinib (Fig. 3)<\/strong>.<\/p>\n

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\nIl sequenziamento di una biopsia tissutale ha rivelato una mutazione KRAS (p.G13D) suggestiva di resistenza agli EGFR-TKI. Il paziente \u00e8 passato alla chemioterapia a breve termine a causa dei gravi effetti collaterali dei TKI EGFR, seguita dal trattamento con l’inibitore PD 1 nivolumab. La diagnostica per immagini ha mostrato una progressione del tumore in questo periodo. A causa dell’inaccessibilit\u00e0 del tumore, \u00e8 stata eseguita una biopsia liquida: Oltre alla mutazione EGFR originale, sono state rilevate una mutazione TP53 e una mutazione EGFR T790M. Quest’ultimo \u00e8 predittivo della risposta a osimertinib. Il paziente \u00e8 stato trattato con osimertinib e ha mostrato una risposta parziale nella tomografia computerizzata due mesi dopo l’inizio della terapia.<\/p>\n

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Letteratura:<\/p>\n

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  1. Cheung KJ, et al.:  Una via collettiva alla metastasi: la semina da parte di gruppi di cellule tumorali. Science 2016 Apr 8; 352(6282): 167-169.<\/li>\n
  2. De Bono JS, et al: Le cellule tumorali circolanti predicono il beneficio di sopravvivenza dal trattamento nel cancro alla prostata metastatico resistente alla castrazione. Clin Cancer Res 2008 Oct 1; 14(19): 6302-6309.<\/li>\n
  3. Lohr JG, et al: Il sequenziamento dell’intero esoma delle cellule tumorali circolanti fornisce una finestra sul cancro alla prostata metastatico. Nat Biotechnol 2014 maggio; 32(5): 479-484.<\/li>\n
  4. Antonarakis ES, et al: AR-V7 e resistenza a enzalutamide e abiraterone nel cancro alla prostata. N Engl J Med 2014 Sep 11; 371(11): 1028-1038.  <\/li>\n
  5. Bettegowda C, et al: Rilevamento del DNA tumorale circolante nei tumori umani in fase iniziale e avanzata. Sci Transl Med 2014 Feb 19; 6(224): 224ra24.<\/li>\n
  6. Dawson SJ, et al: Analisi del DNA tumorale circolante per monitorare il cancro al seno metastatico. N Engl J Med 2013 Mar 28; 368(13): 1199-1209.<\/li>\n<\/ol>\n

    \nInFo ONCOLOGIA ED EMATOLOGIA 2016; 4(4): 10-13<\/em><\/p>\n

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