{"id":341220,"date":"2016-07-20T02:00:00","date_gmt":"2016-07-20T00:00:00","guid":{"rendered":"https:\/\/medizinonline.com\/nova-dimensao-da-analise-preditiva-de-marcadores-nao-invasivos-em-tumores\/"},"modified":"2016-07-20T02:00:00","modified_gmt":"2016-07-20T00:00:00","slug":"nova-dimensao-da-analise-preditiva-de-marcadores-nao-invasivos-em-tumores","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/medizinonline.com\/pt-pt\/nova-dimensao-da-analise-preditiva-de-marcadores-nao-invasivos-em-tumores\/","title":{"rendered":"Nova dimens\u00e3o da an\u00e1lise preditiva de marcadores n\u00e3o invasivos em tumores"},"content":{"rendered":"

No diagn\u00f3stico de tumores, o termo biopsias l\u00edquidas refere-se \u00e0 an\u00e1lise de ADN livre de c\u00e9lulas circulantes (cfDNA) e c\u00e9lulas tumorais circulantes. Actualmente, \u00e9 poss\u00edvel detectar as muta\u00e7\u00f5es de um tumor em tumores avan\u00e7ados de uma forma minimamente invasiva, utilizando an\u00e1lises cfDNA. O plasma, n\u00e3o o soro, deve ser utilizado para testes de cfDNA. As c\u00e9lulas tumorais circulantes poder\u00e3o ser utilizadas para an\u00e1lise de marcadores preditivos num futuro pr\u00f3ximo, tal como para a determina\u00e7\u00e3o da variante de emenda de AR-V7 no carcinoma da pr\u00f3stata resistente \u00e0 castra\u00e7\u00e3o.<\/strong><\/p>\n

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Embora o termo bi\u00f3psias l\u00edquidas seja relativamente novo no contexto do diagn\u00f3stico de tumores moleculares, tornou-se amplamente aceite entre patologistas e oncologistas. No diagn\u00f3stico de tumores, este termo foi primeiro utilizado para a an\u00e1lise de c\u00e9lulas tumorais circulantes (CTC) e s\u00f3 mais tarde para ADN livre de c\u00e9lulas circulantes (cfDNA). Em resumo, este \u00e9 um termo gen\u00e9rico para a remo\u00e7\u00e3o de material de um tumor s\u00f3lido atrav\u00e9s da simples recolha de uma amostra de sangue. No entanto, o termo “biopsia l\u00edquida” n\u00e3o se limita exclusivamente ao uso em diagn\u00f3sticos de tumores: No diagn\u00f3stico pr\u00e9-natal, as amostras de sangue podem ser utilizadas para tirar conclus\u00f5es sobre anomalias cromoss\u00f3micas no feto.<\/p>\n

Interesse na detec\u00e7\u00e3o minimamente invasiva<\/h2>\n

As c\u00e9lulas tumorais circulantes (CTC) e o ADN sem c\u00e9lulas circulantes (cfDNA) t\u00eam sido pesquisados durante d\u00e9cadas e discutidos como poss\u00edveis marcadores de diagn\u00f3stico e progn\u00f3stico na literatura. A primeira descri\u00e7\u00e3o do CTC teve lugar no s\u00e9culo XIX pelo australiano J. Ashworth (1869), a do cfDNA um pouco menos de um s\u00e9culo depois pelos dois franceses P. Mandel e P. Metais (1948).<\/p>\n

O CTC pode ter origem no tumor prim\u00e1rio, bem como nas met\u00e1stases. Ainda n\u00e3o \u00e9 claro se a liberta\u00e7\u00e3o de CTC \u00e9 um processo activo e, portanto, parte de um programa biol\u00f3gico de um tumor, ou se a liberta\u00e7\u00e3o ocorre de forma aleat\u00f3ria. No entanto, sabe-se que algumas destas c\u00e9lulas t\u00eam a capacidade de sobreviver na corrente sangu\u00ednea e continuam a multiplicar-se noutros locais do corpo humano. para formar uma met\u00e1stase. Discute-se de forma controversa se c\u00e9lulas \u00fanicas s\u00e3o suficientes para isso ou se as associa\u00e7\u00f5es (aglomerados) de c\u00e9lulas tumorais n\u00e3o s\u00e3o respons\u00e1veis pelo processo de met\u00e1stase hematog\u00e9nica \u00e0 dist\u00e2ncia [1].  <\/p>\n

O ADN circulante sem c\u00e9lulas (cfDNA), por outro lado, prov\u00e9m de c\u00e9lulas moribundas (apopt\u00f3ticas ou necr\u00f3ticas). O cfDNA \u00e9 constitu\u00eddo por ADN de c\u00e9lulas tumorais (ADN tumoral sem c\u00e9lulas circulantes, ctDNA abreviado) e c\u00e9lulas saud\u00e1veis (ADN normal sem c\u00e9lulas circulantes, cnDNA abreviado). \u00c9 controverso se o cfDNA no sangue desempenha uma fun\u00e7\u00e3o. Em compara\u00e7\u00e3o com o CTC (1-2,5 horas), cfDNA tem uma meia-vida relativamente curta de 15-30 minutos.<\/p>\n

Tanto o CTC como o cfDNA\/ctDNA est\u00e3o a ganhar forte import\u00e2ncia para o diagn\u00f3stico de tumores gra\u00e7as \u00e0s novas possibilidades de investiga\u00e7\u00f5es gen\u00f3micas. Actualmente, a Next Generation Sequencing (NGS) permite a sequencia\u00e7\u00e3o de genomas inteiros num espa\u00e7o de tempo muito curto. Desde a utiliza\u00e7\u00e3o desta tecnologia num grande n\u00famero de ensaios cl\u00ednicos, o n\u00famero de marcadores gen\u00f3micos potencialmente preditivos tem aumentado acentuadamente e, consequentemente, o interesse na detec\u00e7\u00e3o minimamente invasiva destes marcadores preditivos no sangue.<\/p>\n

Determinar as muta\u00e7\u00f5es de forma significativa<\/h2>\n

Em compara\u00e7\u00e3o com a sequencia\u00e7\u00e3o Sanger convencional, o NGS permite que regi\u00f5es maiores sejam sequenciadas simultaneamente e especialmente com uma grande profundidade (redund\u00e2ncia). Esta profundidade \u00e9 necess\u00e1ria se se quiser detectar muta\u00e7\u00f5es subclonais ou se o ADN do tumor representar apenas uma frac\u00e7\u00e3o do ADN total a ser analisado. Este \u00faltimo \u00e9 o caso da an\u00e1lise do ctDNA: Dependendo da entidade tumoral e da fase da doen\u00e7a tumoral, o conte\u00fado de ctDNA no sangue pode variar muito ou atingir at\u00e9 alguns por mililitro.<\/p>\n

Com a maioria dos sequenciadores NGS, os protocolos padr\u00e3o podem detectar muta\u00e7\u00f5es que representam apenas 2-5% do ADN total. No entanto, o ctDNA est\u00e1 frequentemente abaixo deste limiar, especialmente em tumores ainda n\u00e3o avan\u00e7ados ou em pacientes submetidos a terapia. Em contraste com o NGS, a PCR digital permite a determina\u00e7\u00e3o de uma muta\u00e7\u00e3o nesta gama altamente sens\u00edvel: com a ajuda de sondas espec\u00edficas com r\u00f3tulo fluorescente, certas muta\u00e7\u00f5es podem ser determinadas significativamente na gama de 0,01%. O procedimento e t\u00e9cnica s\u00e3o descritos utilizando o exemplo da PCR digital de got\u00edculas (Fig. 1) <\/strong>. A desvantagem deste m\u00e9todo \u00e9 que deve ser realizada uma reac\u00e7\u00e3o separada para cada muta\u00e7\u00e3o a ser determinada. N\u00e3o se recomenda, portanto, a utiliza\u00e7\u00e3o desta metodologia para uma investiga\u00e7\u00e3o geral do genoma, mas apenas para a investiga\u00e7\u00e3o de muta\u00e7\u00f5es \u00fanicas.<\/p>\n

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C\u00e9lulas tumorais circulantes (CTC)<\/h2>\n

Na \u00faltima d\u00e9cada, houve uma s\u00e9rie de estudos que mostram que a detec\u00e7\u00e3o de uma maior quantidade de CTC no sangue de doentes com cancro avan\u00e7ado est\u00e1 associada \u00e0 fraca sobreviv\u00eancia [2]. Neste contexto, a autoridade reguladora americana FDA aprovou a recolha do n\u00famero de CTC para a avalia\u00e7\u00e3o do progn\u00f3stico em pacientes com cancro da pr\u00f3stata metast\u00e1sico, colorrectal e da mama utilizando o dispositivo CellSearch\u00ae<\/sup> (Veridex). Este \u00e9 o \u00fanico dispositivo aprovado pela FDA para a determina\u00e7\u00e3o do CTC.<\/p>\n

A detec\u00e7\u00e3o ou enriquecimento de c\u00e9lulas tumorais circulantes continua a ser um desafio tecnol\u00f3gico: Em 10 ml de sangue total existem cerca de 50 mil milh\u00f5es de gl\u00f3bulos vermelhos, 50 milh\u00f5es de gl\u00f3bulos brancos, mas apenas entre 0 e 100 CTC. Basicamente, existem dois m\u00e9todos t\u00e9cnicos para detectar e registar o CTC no sangue. Pode-se utilizar para isso uma abordagem baseada nas propriedades biol\u00f3gicas do CTC, em particular na express\u00e3o de prote\u00ednas que s\u00f3 se encontram no CTC mas n\u00e3o nas c\u00e9lulas sangu\u00edneas. Assim, o CTC pode ser capturado com anticorpos contra prote\u00ednas espec\u00edficas de c\u00e9lulas epiteliais, tais como EpCAM ou citoceratinas. Outra possibilidade \u00e9 reconhecer o CTC com base nas suas diferentes propriedades f\u00edsicas, tais como densidade, tamanho ou deformabilidade.<\/p>\n

Diagn\u00f3stico preditivo de tumores CTC para o futuro<\/h2>\n

No passado, os ensaios cl\u00ednicos centravam-se no n\u00famero de CTC e na correla\u00e7\u00e3o com a sobreviv\u00eancia. Devido ao progresso tecnol\u00f3gico, \u00e9 agora poss\u00edvel pescar estas c\u00e9lulas e analis\u00e1-las usando NGS ou outras tecnologias, tais como a PCR em tempo real [3]. Embora esta abordagem seja actualmente utilizada principalmente na investiga\u00e7\u00e3o, h\u00e1 esperan\u00e7as justificadas de que o diagn\u00f3stico preditivo de tumores possa ser realizado nestas c\u00e9lulas no futuro.<\/p>\n

O exemplo mais promissor de utiliza\u00e7\u00e3o preditiva de CTC at\u00e9 \u00e0 data \u00e9 a determina\u00e7\u00e3o do estado AR-V7 em doentes com cancro da pr\u00f3stata resistente \u00e0 castra\u00e7\u00e3o. AR-V7 \u00e9 uma variante de emenda do gene receptor androg\u00e9nio que leva a uma prote\u00edna alterada que \u00e9 constitutivamente activa. Antonarakis et al. foram capazes de mostrar que os doentes cujo CTC expressou o AR-V7 RNA reagiram pior \u00e0s terapias com enzalutamida e abiraterona [4]. O ensaio utilizado neste estudo baseia-se na captura do CTC usando anticorpos e realizando PCR em tempo real com iniciadores AR-V7 espec\u00edficos sobre o mRNA extra\u00eddo. Este teste AR-V7 baseado no CTC ser\u00e1 comercializado num futuro pr\u00f3ximo. Pode ser considerado um marco para o uso de CTC para detectar muta\u00e7\u00f5es, fus\u00f5es de genes e outros marcadores preditivos.<\/p>\n

ADN sem c\u00e9lulas circulantes (cfDNA)<\/h2>\n

Enquanto os primeiros estudos de cfDNA investigaram uma poss\u00edvel correla\u00e7\u00e3o da quantidade de cfDNA com o progn\u00f3stico, actualmente o NGS pode ser utilizado para determinar a sequ\u00eancia base do cfDNA (ou seja, ctDNA) proveniente das c\u00e9lulas tumorais. Uma vez que a diferencia\u00e7\u00e3o entre cfDNA geral e ctDNA n\u00e3o \u00e9 poss\u00edvel por raz\u00f5es t\u00e9cnicas ao extrair cfDNA, a maioria do cfDNA pode consistir em cnDNA e n\u00e3o em ctDNA. Para que ainda seja poss\u00edvel determinar as muta\u00e7\u00f5es no ctDNA, deve ser conseguida uma grande profundidade com NGS. O plasma sangu\u00edneo \u00e9 necess\u00e1rio para o teste de cfDNA.<\/p>\n

Usando NGS, foi recentemente poss\u00edvel detectar as muta\u00e7\u00f5es do tumor no ctDNA de at\u00e9 75% dos pacientes com tumores avan\u00e7ados [5]. Em tumores n\u00e3o avan\u00e7ados, a taxa de detec\u00e7\u00e3o cai para cerca de 50%. No entanto, pode assumir-se que estas taxas ir\u00e3o aumentar atrav\u00e9s da utiliza\u00e7\u00e3o de m\u00e9todos mais sens\u00edveis.
\nV\u00e1rios estudos t\u00eam demonstrado que a quantidade de ctDNA est\u00e1 correlacionada com a carga tumoral: se o tumor responder \u00e0 terapia, a quantidade de ctDNA no sangue do paciente diminui. O oposto \u00e9 verdadeiro para a ocorr\u00eancia de uma recorr\u00eancia: num pequeno grupo de doentes com cancro da mama, Dawson et al. mostram um aumento dos n\u00edveis de ctDNA sangu\u00edneo semanas antes que a imagem padr\u00e3o pudesse detectar a recidiva [6]. Para estes exames, \u00e9 suficiente determinar ou quantificar algumas muta\u00e7\u00f5es no sangue espec\u00edficas do tumor correspondente. Se se quiser usar biopsia l\u00edquida para investigar se o tumor de um paciente tem uma muta\u00e7\u00e3o preditiva, os chamados pain\u00e9is s\u00e3o normalmente usados para sequencia\u00e7\u00e3o, que variam muito em tamanho (Fig. 2)<\/strong>.<\/p>\n

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\nOs pain\u00e9is padr\u00e3o utilizados no diagn\u00f3stico de tumores cobrem muta\u00e7\u00f5es entre 20 e 50 genes. Estes genes s\u00e3o genes relevantes para a terapia, tais como EGFR, KRAS, NRAS ou BRAF. Uma vez que, tal como mencionado, s\u00e3o necess\u00e1rias grandes profundidades de sequencia\u00e7\u00e3o para cfDNA, os recursos e custos de sequencia\u00e7\u00e3o aumentam com o tamanho do painel.<\/p>\n

Devido \u00e0 elevada relev\u00e2ncia cl\u00ednica das aplica\u00e7\u00f5es, os exames baseados em cfDNA j\u00e1 est\u00e3o agora muito pr\u00f3ximos da pr\u00e1tica cl\u00ednica di\u00e1ria: o departamento de patologia do Hospital Universit\u00e1rio de Basileia oferece an\u00e1lises cfDNA para diagn\u00f3sticos desde Abril deste ano. Neste processo, o cfDNA dos pacientes \u00e9 analisado para detectar muta\u00e7\u00f5es com propriedades preditivas utilizando pain\u00e9is NGS ou PCR digital. Isto \u00e9 de particular interesse se uma bi\u00f3psia de tecido n\u00e3o for poss\u00edvel ou n\u00e3o for razo\u00e1vel para um paciente. Esta aplica\u00e7\u00e3o est\u00e1 actualmente a ser introduzida principalmente no diagn\u00f3stico preditivo de carcinomas pulmonares. No entanto, \u00e9 previs\u00edvel uma expans\u00e3o para outras entidades tumorais.
\nAtrav\u00e9s de exames cfDNA, as muta\u00e7\u00f5es EGFR conhecidas e relevantes para a terapia podem ser determinadas de forma n\u00e3o invasiva, em particular tamb\u00e9m a muta\u00e7\u00e3o EGFR T790M, que \u00e9 preditiva para a resposta ao osimertinib em pacientes com resist\u00eancia aos inibidores de tirosina quinase EGFR (EGFR-TKIs).<\/p>\n

Um caso da pr\u00e1tica<\/h2>\n

H\u00e1 tr\u00eas anos, foi detectada uma muta\u00e7\u00e3o no gene EGFR (p.E746-T751delinsF) num doente com um adenocarcinoma TTF1 positivo, est\u00e1dio IV do pulm\u00e3o, sequenciando c\u00e9lulas tumorais de um lavado broncoalveolar. O doente foi ent\u00e3o tratado com o EGFR TKI erlotinib durante oito meses e subsequentemente, como terapia de segunda linha, com afatinibe (Fig. 3)<\/strong>.<\/p>\n

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\nA sequ\u00eancia de uma bi\u00f3psia de tecido revelou uma muta\u00e7\u00e3o KRAS (p.G13D) sugestiva de resist\u00eancia a EGFR-TKIs. O paciente foi submetido a quimioterapia de curto prazo devido aos graves efeitos secund\u00e1rios das TKIs EGFR, seguido de tratamento com o inibidor PD 1 nivolumab. As imagens mostraram a progress\u00e3o de tumores neste momento. Devido \u00e0 inacessibilidade do tumor, foi realizada uma bi\u00f3psia l\u00edquida: Al\u00e9m da muta\u00e7\u00e3o EGFR original, foram recentemente detectadas uma muta\u00e7\u00e3o TP53 e uma muta\u00e7\u00e3o EGFR T790M. Este \u00faltimo \u00e9 preditivo de resposta ao osimertinib. O paciente foi tratado com osimertinibe e mostrou uma resposta parcial em tomografia computorizada dois meses ap\u00f3s ter iniciado a terapia.<\/p>\n

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Literatura:<\/p>\n

    \n
  1. Cheung KJ, et al.:  Uma via colectiva para a met\u00e1stase: Semeadura por grupos de c\u00e9lulas tumorais. Ci\u00eancia 2016 Abril 8; 352(6282): 167-169.<\/li>\n
  2. De Bono JS, et al: As c\u00e9lulas tumorais circulantes prev\u00eaem o benef\u00edcio da sobreviv\u00eancia do tratamento no cancro da pr\u00f3stata resistente \u00e0 castra\u00e7\u00e3o metast\u00e1tica. Clin Cancer Res 2008 Oct 1; 14(19): 6302-6309.<\/li>\n
  3. Lohr JG, et al: A sequ\u00eancia completa de c\u00e9lulas tumorais circulantes proporciona uma janela para o cancro da pr\u00f3stata metast\u00e1sico. Nat Biotechnol 2014 Maio; 32(5): 479-484.<\/li>\n
  4. Antonarakis ES, et al: AR-V7 e resist\u00eancia \u00e0 enzalutamida e \u00e0 abiraterona no cancro da pr\u00f3stata. N Engl J Med 2014 Set 11; 371(11): 1028-1038.  <\/li>\n
  5. Bettegowda C, et al: Detec\u00e7\u00e3o de ADN de tumores circulantes em fases iniciais e tardias de malignidade humana. Sci Transl Med 2014 Fev 19; 6(224): 224ra24.<\/li>\n
  6. Dawson SJ, et al: An\u00e1lise de ADN tumoral circulante para monitorizar o cancro da mama metast\u00e1sico. N Engl J Med 2013 Mar 28; 368(13): 1199-1209.<\/li>\n<\/ol>\n

    \nInFo ONCOLOGy & HEMATOLOGy 2016; 4(4): 10-13<\/em><\/p>\n

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