La proteina 2, che contiene il dominio LEM, è essenziale per lo sviluppo del cuore.

L’integrità dell’involucro nucleare è essenziale per la compartimentazione del nucleo e del citoplasma. È importante notare che le mutazioni nei geni che codificano l’involucro nucleare e le proteine associate sono la seconda causa più comune di cardiomiopatia dilatativa familiare. Una di queste proteine NE che causa la cardiomiopatia negli esseri umani e influenza lo sviluppo del cuore nei topi è Lem2.

(rosso) L’involucro nucleare (NE) nelle cellule eucariotiche separa i compartimenti nucleari e citoplasmatici l’uno dall’altro. Al di sotto della NE si trova la lamina nucleare, composta dalle lamine A/C, B1 e B2 [2]. Si ritiene che la lamina nucleare fornisca rigidità strutturale al nucleo e svolga un ruolo nel legame della cromatina e nella regolazione dell’espressione genica [3,4]. La NE è inframmezzata dal complesso LINC (Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton), che attraversa la doppia membrana [5–7]. Nei muscoli striati come il cuore, il complesso LINC e le sue proteine associate hanno dimostrato di essere essenziali per la normale funzione [8–13]. Associate al complesso LINC sono le proteine contenenti i domini peptide associato alla lamina 2 (Lap2), emerina e MAN1 (LEM), che svolgono un ruolo importante anche nel cuore. Infatti, le mutazioni in Emerin, Lap2 e LEM domain-containing 2 (Lem2) sono associate alla distrofia muscolare di Emery-Dreifuss con disturbi della conduzione cardiaca, alla cardiomiopatia dilatativa e alla cardiomiopatia aritmogena (AC), rispettivamente [14–18]. In particolare, una mutazione da leucina-13 ad arginina (L13R) in Lem2 porta all’AC e alla morte improvvisa [16,17]. Inoltre, una mutazione C-terminale che cambia la serina 479 in fenilalanina (S479F) porta al blocco di branca destra e all’ipertrofia settale [18].

Si ritiene che Lem2 svolga un ruolo in vitro e negli organismi inferiori. Si va dalla riparazione della NE e dal recapping dopo la mitosi al mantenimento della forma nucleare, alla regolazione dell’eterocromatina e dell’espressione genica e alla regolazione della segnalazione della proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPK) [19–27]. Nei topi, la perdita globale di Lem2 ha provocato la letalità embrionale tra E10.5 e E11.5, con dimensioni corporee totali significativamente inferiori e la maggior parte dei tessuti [28]. I difetti di sviluppo più specifici comprendevano una neurogenesi ridotta nei tessuti neuronali e pareti miocardiche più sottili nel cuore. Tuttavia, il ruolo specifico che Lem2 svolge nel cuore è ancora insufficientemente compreso.

Lem2 è essenziale per il normale sviluppo del cuore

Per indagare il ruolo di Lem2 nella funzione cardiaca, uno studio recente [1] ha generato topi knockout specifici per i cardiomiociti, definiti Lem2 cKO, utilizzando un approccio Cre-LoxP. L’ablazione di Lem2 è stata confermata dalle analisi di Western blotting (WB) e di immunofluorescenza. La maggior parte dei topi Lem2 cKO non è sopravvissuta fino al giorno embrionale 18,5 (E18,5), indicando la letalità nelle ultime fasi fetali. La biopsia del tessuto a E18,5 ha rivelato che i cuori Lem2 cKO erano più piccoli e avevano atri allargati in cui il sangue si accumulava, indicando una funzione cardiaca anormale. Per approfondire questo aspetto, è stata eseguita la microscopia episcopica ad alta risoluzione (HREM) per la ricostruzione degli organi in 3D e le analisi morfologiche [29]. Sorprendentemente, non sono stati osservati difetti congeniti evidenti che coinvolgessero uno sviluppo ventricolare anormale, il che spiega la morte fetale nei topi Lem2 cKO. Tuttavia, lo spessore della parete dei ventricoli era leggermente ridotto in E14,5, cosa che era ancora più pronunciata in E16,5 e indica un ritardo nello sviluppo. Tuttavia, non sono stati rilevati cambiamenti nell’organizzazione trabecolare, che è stata eseguita utilizzando analisi frattali sui dati HREM a E16,5 per quantificare la complessità morfologica.

L’ablazione di Lem2 attiva la morte cellulare e inibisce i percorsi di sviluppo cardiaco

Per valutare ulteriormente i cambiamenti nello sviluppo del cuore, è stata eseguita un’analisi di sequenziamento dell’RNA a E14,5 su cuori interi di controllo e Lem2 cKO. L’espressione genica differenziale ha mostrato cambiamenti lievi ma significativi nell’espressione genica, con 92 e 49 geni significativamente upregolati e downregolati, rispettivamente (Fig. 1A) [1]. L’analisi di Gene Ontology (GO) ha rivelato un arricchimento significativo della morte cellulare apoptotica e una riduzione dei processi importanti per il corretto sviluppo cardiaco, compresi quelli coinvolti nella morfogenesi, nella contrazione e nella conduzione (Fig. 1B, C e F) [1]. I geni upregolati includevano Gadd45b e Gadd45g, che sono associati alla morte cellulare [30,31], così come Fos, Spp1 e Arrdc3. I geni downregolati includevano Rnf207, Kcnq1 e Cacng6, che sono associati alla conduzione e alla contrazione cardiaca, e Adamts6, che regola la morfogenesi cardiaca [32–35] (Fig. 1G e H) [1]. Questi cambiamenti sono stati rilevati sia a livello di mRNA che di proteine (Fig. 1E e H) [1], dimostrando che Lem2 è necessario per la vitalità cellulare ed è essenziale per la normale espressione genica durante lo sviluppo del cuore.

La perdita di Lem2 porta all’apoptosi dei cardiomiociti, all’accumulo di danni al DNA e ai micronuclei.

Per verificare se il percorso di morte cellulare upregolato porta all’apoptosi, i cuori sono stati etichettati per la caspasi 3 scissa, che ha confermato un alto livello di apoptosi nei cuori Lem2 cKO tra E13,5 e E16,5, in linea con i risultati nei tubi neurali di topi Lem2 KO globali [28]. Di conseguenza, è stata osservata di routine una riduzione del 41% circa del numero di cardiomiociti isolati da cuori E14.5 di cKO rispetto ai controlli (media ± SD: 94 500 ± 25 500 vs. 159 900 ± 34 700 cardiomiociti).

Questi risultati sono stati confermati da un modello indipendente in cui l’espressione di Cre è stata guidata dal promotore della troponina T cardiaca (cTnT) per generare cuori Lem2f/f; cTnT-Cre/+ cKO [36]. Dato che Lem2 è un regolatore della segnalazione MAPK [28], sono state esaminate queste vie e si è scoperto che i cuori Lem2 cKO avevano livelli elevati di attivazione ERK1/2 ma non p38. I cuori Lem2 cKO hanno mostrato un aumento dei livelli di γH2AX (che contrassegna le rotture del doppio filamento del DNA) [37] e micronuclei a E14,5 e E16,5.

Lo sviluppo del cuore è strettamente regolato e richiede un equilibrio preciso tra proliferazione e apoptosi. Pertanto, è stata utilizzata la colorazione EdU e antifosfo-istone H3 per etichettare le cellule in fase di sintesi del DNA e di mitosi, rispettivamente. I tassi di proliferazione tra i genotipi erano comparabili.

I nuclei dei cardiomiociti privi di Lem2 hanno una forma anomala e sono più suscettibili alla rottura meccanica.

Dopo aver osservato un aumento dell’apoptosi, dei danni al DNA e dei micronuclei in vivo, i cardiomiociti sono stati placcati su idrogeli PDMS morbidi a una pressione di 6 kPa per imitare la rigidità del cuore in vivo [38–40]. Nei cardiomiociti E14.5 Lem2 cKO sono state osservate una forma nucleare diversa e un’area nucleare allargata rispetto alle cellule di controllo (Fig. 2A-C) [1].

Per valutare l’integrità della NE e osservare se un processo simile si verifica nei cardiomiociti Lem2 cKO, la guanosina monofosfato ciclica cataliticamente inattiva adenosina monofosfato sintasi (cGAS) fusa con un tag fluorescente mScarlet è stata espressa transitoriamente nei cardiomiociti Lem2 cKO per marcare l’esposizione della cromatina citoplasmatica e quindi gli eventi di rottura nucleare [41,42]. Nelle cellule Lem2 cKO è stata osservata un’incidenza significativamente maggiore di rottura nucleare rispetto alle cellule di controllo, dimostrando un ruolo importante di Lem2 nel mantenere l’integrità nucleare (Fig. 2D) [1]. Osservazioni simili sono state fatte quando le cellule sono state piastrate su vetro, che è molto più rigido dell’idrogel (Fig. 2B-D) [1].

In precedenza, è stato dimostrato che cGAS è associato alla cromatina dopo il collasso di NE durante la mitosi e che NE non è stato risigillato dopo la mitosi [43-45], il che può contribuire alle quantità di cGAS osservate a NE. Per determinare se l’accumulo di cGAS nella NE è dovuto alla rottura durante l’interfase (NERDI) o alla risigillatura difettosa della NE dopo la mitosi. [46]L’imaging di cellule vive è stato eseguito durante la notte sui cardiomiociti che esprimono cGAS e la frequenza di accumulo di cGAS al NE è stata monitorata nei cardiomiociti che non hanno subito la mitosi. Valori elevati di NERDI (~8 e ~1%) sono stati osservati per Lem2 cKO per 16 ore rispetto ai controlli (Fig. 2E) [1]. Come ulteriore prova che l’accumulo di cGAS al NE è in gran parte il risultato delle NERDI, i cardiomiociti sono stati trasdotti con BAF-GFP come marcatore delle cicatrici NERDI [46]. In Lem2 cKO, è stata osservata una localizzazione BAF significativamente maggiore a livello del NE rispetto al controllo, che ricorda i dati di cGAS. In linea con questo, è stata osservata una concordanza quasi del 100% della localizzazione di BAF con cGAS ai focolai NE.

L’inibizione della contrazione muscolare indebolisce i difetti di forma e le rotture dei nuclei

Poiché i nuclei dei cardiomiociti sono sottoposti a uno stress meccanico costante attraverso il complesso LINC, che trasmette la forza dai sarcomeri allo scheletro nucleare, i cardiomiociti sono stati trattati con para-nitroblebbistatina, che inibisce la miosina e arresta la contrazione muscolare [47]. Questo agente è stato in grado di attenuare completamente i difetti dello stampo nucleare e le rotture (Fig. 2F-J) [1].

Poiché la para-nitroblebbistatina è un inibitore generale della famiglia della miosina di classe II, la contrazione muscolare è stata inibita in modo specifico con un meccanismo diverso, utilizzando il verapamil, un farmaco usato clinicamente che inibisce i canali del calcio voltaggio-gati per influenzare l’accoppiamento eccitazione-contrazione. Allo stesso modo, il verapamil è stato in grado di salvare completamente le forme aberranti e le fessure nei nuclei dei cardiomiociti (Fig. 2F-J) [1] [48,49]. Per verificare ulteriormente se l’integrità dei nuclei è influenzata dalla contrazione muscolare, è stato usato un attivatore della miosina cardiaca (Omecamtiv mecarbil) per stimolare la contrazione muscolare. In seguito alla stimolazione della contrazione muscolare, è stata osservata una maggiore rottura nucleare nei nuclei Lem2 cKO (Fig. 2G, H, J) [1]. Infatti, nei cardiomiociti cKO è stato rilevato un aumento del danno al DNA rispetto ai controlli, che poteva essere invertito inibendo la contrazione muscolare (Fig. 2K) [1]. Questi risultati indicano che Lem2 nei cardiomiociti è essenziale per il mantenimento dell’integrità della NE e del genoma sotto lo stress meccanico causato dalle forze di contrazione muscolare. Tuttavia, analisi dettagliate di WB e immunofluorescenza non hanno mostrato differenze rilevabili nella maggior parte delle proteine NE e della lamina tra i genotipi.

Nei topi Lem2-iCKO non si osservano difetti evidenti nella funzione cardiaca.

Dopo aver scoperto che Lem2 è essenziale nei cardiomiociti fetali, è sorta la domanda se svolge un ruolo simile anche negli adulti. Pertanto, dopo che l’espressione di Lem2 nei cardiomiociti adulti è stata rilevata utilizzando cellule isolate e fette di cuore (Fig. 3A e B) [1], sono stati generati topi Lem2 inducibili ad eliminazione condizionale (iCKO) utilizzando una linea di topi Cre specifica per i cardiomiociti, indotta dal tamoxifene, Tnnt2MerCreMer/+ [50].

Le ecocardiografie sono state eseguite a otto settimane di età e prima dell’ablazione Lem2 a nove settimane di età, seguite da ecocardiografie seriali a 33, 48 e 83 settimane di età. La funzione cardiaca e lo spessore della parete dei topi Lem2 iCKO erano paragonabili a quelli dei topi di controllo in tutte le misurazioni e a tutte le età (Fig. 3C-E) [1]. Non sono stati osservati cambiamenti nei livelli di espressione del programma genico fetale e dei marcatori pro-fibrotici mediante l’analisi quantitativa RT-PCR, indicando che non c’è stato alcun rimodellamento avverso o fibrosi.

Oltre alle analisi ecocardiografiche e di espressione genica, l’analisi istologica non ha rivelato alcuna evidenza di difetti morfologici, cambiamenti nella deposizione di matrice extracellulare o cambiamenti nelle dimensioni dei miociti (Fig. 3F) [1]. Inoltre, non ci sono stati cambiamenti nel rapporto tra peso del cuore e lunghezza delle costole e tra peso del cuore e peso corporeo nei topi Lem2 iCKO rispetto ai topi di controllo. Questi dati suggeriscono che la rimozione di Lem2 non influisce sulla funzione cardiaca fino a 83 settimane di età, una volta che il cuore del topo adulto si è sviluppato completamente.

La maggior parte dei livelli di proteine NE sono invariati nei cuori Lem2 iCKO e nei cardiomiociti isolati.

Data la mancanza del fenotipo di base nei topi Lem2 iCKO, si è ipotizzato che altre proteine NE possano compensare Lem2, come precedentemente dimostrato in altri sistemi [51,52]. Per verificarlo, sono stati eseguiti dei WB su cuori interi di topi di controllo e di topi Lem2 iCKO e analizzati per una serie di proteine NE e della lamina (Fig. 3G) [1]. Come previsto, la concentrazione di Lem2 in Lem2 iCKO è stata ridotta al 46% della concentrazione di controllo. Altre proteine sono rimaste invariate, ad eccezione della proteina SUN2 del complesso LINC, che è aumentata di 1,5 volte rispetto al controllo (p<0,01).

I livelli di immunofluorescenza e la localizzazione della maggior parte delle proteine NE sono rimasti invariati, ad eccezione di Lem2, che era significativamente ridotto nei cardiomiociti iCKO, e di un leggero aumento di SUN2, che era coerente con i WB. I livelli di trascrizione mRNA di Sun2 (così come di altri componenti del complesso LINC) erano simili tra i genotipi, suggerendo che l’aumento di SUN2 osservato nei cardiomiociti Lem2 iCKO è probabilmente regolato a livello proteico piuttosto che a livello di espressione genica.

L’integrità nucleare e la rigidità non sono compromesse nei cardiomiociti adulti Lem2 iCKO

Le analisi complete in 2D e 3D dei nuclei dei cardiomiociti non hanno rivelato differenze nei parametri di forma tra i genotipi. È interessante notare, tuttavia, che le invaginazioni della NE/lamina sono state osservate sia nei controlli che nei topi iCKO, ma in misura simile in entrambi i genotipi.

Il lavoro precedente ha dimostrato che le mutazioni nei partner di interazione di Lem2, le lamine A e C, influenzano la rigidità del nucleo e rendono i nuclei più deformabili sotto stress meccanico [4]. Per verificare se questo è anche il caso di Lem2 iCKO, è stata eseguita la nanoindentazione su cardiomiociti adulti di Lem2 iCKO e di topi di controllo. Il modulo di elasticità calcolato ha mostrato rigidità del nucleo comparabili tra Lem2 iCKO e i topi di controllo (1,01 e 1,26 kPa, rispettivamente). Lem2 non è quindi necessario per la normale morfologia e meccanica nucleare nei cardiomiociti di topo adulto.

La forma nucleare è mantenuta in risposta all’aumento della pressione nei cardiomiociti adulti Lem2 iCKO

Data la mancanza del fenotipo di base nei cardiomiociti Lem2 iCKO, i nuclei sono stati poi stressati nei cardiomiociti Lem2 iCKO vivi. A questo scopo, sono stati isolati cardiomiociti adulti di Lem2 iCKO o di controlli compagni di cucciolata e sono stati esposti a pressioni idrodinamiche. Questi corrispondono a quelli osservati nei cuori sani, normali o pressurizzati in vivo con uno stimolatore di pressione (CellScale MechanoCulture TR; modificato per una gamma di pressione bassa [53]) [54].

I cardiomiociti adulti di Lem2 iCKO e i controlli della stimolazione oscillatoria sono stati sottoposti a pressione normale (120/15 mmHg) o alta (200/30 mmHg) e sono state eseguite analisi della forma nucleare. È interessante notare che i nuclei dei cardiomiociti di entrambi i genotipi hanno risposto in modo simile all’alta pressione e sono diventati più irregolari e meno circolari, come misurato dalla circolarità, dalla compattezza e dal rapporto di aspetto dei nuclei. Tuttavia, non sono stati osservati cambiamenti nella forma nucleare tra le cellule Lem2 iCKO e quelle di controllo.

Nei cardiomiociti adulti che si sono adattati alle esigenze fisiche della NE, la rimozione di Lem2 non sembra avere alcun effetto sulla funzione cardiaca o sulla forma nucleare. Lem2 non è necessario per mantenere la forma nucleare ad alta pressione nei cardiomiociti adulti. Tuttavia, non si può escludere che il Lem2 rimanente nei cuori Lem2 iCKO sia sufficiente per mantenere la funzione di Lem2 in questo ruolo.

Approfondimento sulla cardiomiopatia da mutazioni Lem2 e cardio-…
Laminopatie

I risultati dello studio suggeriscono che Lem2 è fondamentale per l’integrità della NE in via di sviluppo nel cuore fetale e protegge il nucleo dalle forze meccaniche della contrazione muscolare. Al contrario, il cuore adulto non è influenzato in modo significativo dalla deplezione parziale di Lem2, probabilmente a causa di una NE più consolidata e di un maggiore adattamento allo stress meccanico. Questi dati forniscono approfondimenti sui meccanismi alla base della cardiomiopatia nei pazienti con mutazioni Lem2 e cardio-laminopatie.

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