Miglioramento della diagnostica in vitro per l’allergia ai farmaci e l’anafilassi

Le allergie di tipo immediato ai farmaci possono causare reazioni gravi fino all’anafilassi. Il test di provocazione è ancora il ‘gold standard’, ma comporta il rischio di una nuova reazione allergica. Il test di attivazione dei basofili (BAT) può essere utile in questo caso come test di laboratorio supplementare e come alternativa al test di provocazione.

In clinica, spesso è difficile diagnosticare l’allergia ai farmaci IgE-mediata solo sulla base dell’anamnesi, dei test cutanei (e delle IgE specifiche, se presenti). Spesso le soluzioni per i test prick/intradermici non sono disponibili e la preparazione delle diluizioni per i test cutanei è costosa. Inoltre, esistono solo pochi test sierologici (IgE) per i farmaci.

Mentre un risultato positivo può spesso essere considerato rilevante e conclusivo, un risultato negativo non è sufficiente per escludere l’allergia con certezza, a causa della sensibilità limitata. Pertanto, la provocazione con il farmaco scatenante (o con un preparato strutturalmente correlato come alternativa) è ancora il “gold standard” per la diagnosi inequivocabile di un’allergia ai farmaci di tipo immediato. Bisogna accettare un certo rischio di scatenare nuovamente l’allergia. Se diversi farmaci sono possibili fattori scatenanti, i test possono essere complessi e costosi e non sono pratici in tutti i casi.  Un test in vitro come il test di attivazione dei basofili (BAT) può essere utile in questo caso come test di laboratorio supplementare e come alternativa al test di provocazione.

Granulociti basofili

I granulociti basofili (basofili) costituiscono circa l’1% dei leucociti nel sangue periferico. I basofili e i mastociti, che si trovano nel tessuto e sono simili ai basofili nella funzione, sono le cellule cruciali per le reazioni allergiche acute. I mastociti e i basofili possono essere attivati da percorsi IgE-dipendenti e IgE-indipendenti. In questo articolo, ci limiteremo alle allergie ai farmaci IgE-dipendenti.

Gli anticorpi IgE si legano al recettore IgE ad alta affinità (FcεRI) sulla superficie dei basofili e dei mastociti. I farmaci a piccole molecole spesso si legano a una proteina endogena (ad esempio, l’albumina) e formano così un “nuovo” antigene. Questo può portare alla formazione di anticorpi IgE specifici attraverso le cellule presentanti l’antigene (la cosiddetta sensibilizzazione). Se le IgE farmaco-specifiche sulla superficie cellulare sono legate (cross-linked) dal legame del complesso farmaco-proteina, i basofili/mastociti vengono attivati e rilasciano i mediatori immagazzinati nei loro granuli, ad esempio istamina ed eparina, mediante degranulazione. (Fig.1A). Oltre ai classici sintomi sulla pelle (rossore, orticaria), questo porta anche a broncospasmo, calo della pressione sanguigna e persino shock anafilattico in caso di forte stimolazione.

Test di attivazione dei basofili (BAT)

Le prime pubblicazioni sull’analisi dell’attivazione dei basofili mediante citometria a flusso risalgono ai primi anni ’90 [1]. Nel frattempo, il metodo viene offerto di routine in vari laboratori per diagnosticare le allergie di tipo immediato ai farmaci. La sensibilità del BAT per l’analisi delle allergie ai farmaci dipende dal farmaco ed è per lo più compresa tra il 50-60%, la specificità è di circa l’80% [2–7]. Un risultato positivo indica quindi con forza il farmaco come allergene, mentre un risultato negativo non può escludere definitivamente un’allergia. Anche gli altri risultati dei test (test cutanei, eventualmente provocazione) devono essere presi in considerazione.

Nel BAT, la reazione che si verifica nel corpo viene “ricreata” in laboratorio. Il sangue viene incubato con il farmaco presumibilmente scatenante in sostanza pura e in concentrazione crescente , per cui i basofili presenti nel sangue vengono attivati in caso di sensibilizzazione. Oltre al rilascio di mediatori (istamina, eparina), sulla superficie dei basofili vengono espressi anche vari marcatori di attivazione (CD63 e CD203c), che possono essere quantificati con la citometria a flusso.  

Il test è complesso e si basa su cellule vive, il che richiede un trasporto rapido dei campioni (<24h) e la protezione dalle basse temperature esterne nei mesi invernali. Come controllo positivo e per il controllo di qualità interno, le cellule sono state stimolate anche con anti-IgE (reattività) e con un prodotto batterico (fMLP, controllo di vitalità) (Fig. 1A, 1B). Inoltre, il 10-15% delle persone non risponde alle IgE, quindi i basofili non possono essere attivati tramite il FcεRI e non è possibile fare alcuna dichiarazione sulla sensibilizzazione con il BAT.

Il BAT deve essere utilizzato quando c’è un ragionevole sospetto di allergia ai farmaci. Il seguente gruppo di farmaci si è dimostrato particolarmente adatto: Penicilline, cefalosporine, miorilassanti, inibitori della pompa protonica, fluorochinoloni e vari disinfettanti (tab. 1). Se vengono testati altri farmaci, il test deve essere classificato come sperimentale. Inoltre, si può utilizzare il BAT per analizzare le reattività incrociate. Se, ad esempio, c’è un’allergia alle cefalosporine, si può fare un’analisi iniziale per quanto riguarda la reattività incrociata alle penicilline (spesso all’amoxicillina). Tuttavia, la tollerabilità dovrebbe essere testata in studi di riesposizione da specialisti esperti in questo campo.

Prospettiva: Test di attivazione indiretta dei basofili

Per facilitare il trasporto dei campioni, per consentire l’analisi in pool e allo stesso tempo per affrontare il problema dei non rispondenti alle IgE, si sta lavorando per sviluppare e stabilire il BAT indiretto. In questo processo, le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC), che contengono anche i basofili, vengono isolate da donatori ben caratterizzati. Utilizzando il trattamento con acido lattico, il pH viene ridotto fino a quando le IgE del donatore si staccano dai basofili (IgE stripping). Le cellule “nude” vengono poi incubate con il siero allergico, in modo che le IgE contenute possano legarsi ai basofili del donatore.

I basofili del donatore, così risensibilizzati, possono ora essere stimolati e attivati con i controlli e i farmaci come nel BAT abituale. L’attivazione dei basofili viene nuovamente misurata quantificando l’espressione di CD63 con il citometro a flusso (Fig. 2).

Il vantaggio principale del BAT indiretto rispetto al BAT diretto è certamente che deve essere inviato solo il siero e non le cellule vive. Tuttavia, secondo l’analisi iniziale, la BAT indiretta è leggermente meno sensibile (circa il 10%) rispetto alla BAT diretta. Finora, il BAT indiretto è stato utilizzato solo a scopo di ricerca. Finora, i seguenti farmaci sono risultati positivi nel BAT indiretto: Penicillina G, amoxicillina, cefaclor, cefuroxima, ceftriaxone, ceftazidima, cefotaxima, acido clavulanico, carbossimetilcellulosa, ibuprofene, clorexidina, ottenidina e proguanil (Tab. 1).

Applicazione del BAT nella clinica

Chiarire le allergie ai farmaci è impegnativo perché possono essere coinvolti diversi meccanismi e più farmaci. I test cutanei richiedono una certa esperienza nella gestione dei diversi gruppi di farmaci, le soluzioni corrispondenti non sono spesso disponibili e il test, come il test di provocazione, comporta un certo rischio di recidiva dei sintomi allergici. Pertanto, i chiarimenti sono sempre più centralizzati e, se possibile, eseguiti in vitro.  

Il BAT diretto (invio di cellule!) e in futuro probabilmente anche il BAT indiretto (invio di siero!) possono essere utili in questo settore difficile per una diagnosi affidabile delle allergie ai farmaci. Purtroppo, non è stato ancora possibile valutare tutti i gruppi di farmaci nel BAT (Tab. 1) , ma sono stati registrati i principali fattori scatenanti dell’anafilassi indotta da farmaci. Poiché il test è complesso e relativamente costoso, dovrebbe essere utilizzato solo in casi di sospetto fondato (Fig. 3), in particolare:

• se il test cutaneo non è possibile o se il test cutaneo sembra troppo pericoloso a causa della gravità della reazione iniziale.
• in caso di reazioni a diversi farmaci (ad esempio, anafilassi perioperatoria), o rilevamento o esclusione di reazioni incrociate (ad esempio, allergia al ceftriaxone) e indicazione importante di possibili farmaci tollerati (ad esempio, altri beta-lattamici).

Come per il test cutaneo, la sensibilità del BAT diminuisce con l’intervallo di tempo dall’evento [8–10]. Idealmente, il BAT viene effettuato entro un anno dall’evento.

Rispetto al test di provocazione, il BAT è meno costoso e non comporta ulteriori disagi per il paziente, a parte il prelievo di sangue. Diversi farmaci possono essere testati simultaneamente in un BAT, in modo da poter testare anche eventuali alternative e analizzare le reattività incrociate in vitro.

Messaggi da portare a casa

• Le allergie di tipo immediato ai farmaci possono causare reazioni gravi fino all’anafilassi.
• La diagnosi si basa sull’anamnesi, sui test cutanei e sulle determinazioni delle IgE specifiche, se disponibili.
• Il test di provocazione è ancora il “gold standard”, ma non
• il rischio di una nuova reazione allergica.
• Il test di attivazione dei basofili (BAT) può essere utile in questo caso come test di laboratorio supplementare e come alternativa al test di provocazione.

Letteratura:

1. Knol EF, et al: Monitoraggio dell’attivazione dei basofili umani tramite l’anticorpo monoclonale CD63 435. The Journal of Allergy and Clinical Immunology 1991; 88: 328-38.
2. Aranda A, et al.: Valutazione in vitro delle reazioni di ipersensibilità IgE-mediata ai chinoloni. Allergia 2011; 66(2): 247-254.
3. Ben Said B, et al.: Utilità dei test di attivazione dei basofili per la diagnosi di allergia IgE-mediata ai chinoloni. Allergia 2010; 65(4): 535-536.
4. De Weck AL, et al: Sindrome di ipersensibilità ai farmaci antinfiammatori non steroidei. Uno studio multicentrico. I. Risultati clinici e diagnosi in vitro. Journal of investigational Allergology and Clinical Immunology 2009; 19(5): 355-369.
5. Gamboa PM, et al: Attivazione dei basofili e produzione di sulfidoleucotriene in pazienti con allergia immediata agli antibiotici betalattamici e test cutanei negativi. Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology 2004; 14(4): 278-283.
6. Gamboa PM, et al: Espressione del CD63 mediante citometria a flusso nella diagnosi in vitro dell’allergia all’omeprazolo. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology 2003; 58(6): 538-539.
7. Gamboa PM, et al.: Uso dell’espressione di CD63 come marcatore dell’attivazione dei basofili in vitro e determinazione dei leucotrieni nei pazienti allergici al metamizolo. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology 2003; 58(4): 312-317.
8. Blanca M, et al: Evoluzione naturale della sensibilità al test cutaneo nei pazienti allergici agli antibiotici beta-lattamici. J Allergy Clin Immunol 1999; 103: 918-924.
9. Romano A, et al.: Evoluzione naturale della sensibilità al test cutaneo nei pazienti con ipersensibilità IgE-mediata alle cefalosporine. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology 2014; 69(6): 806-809.
10. Fernández TD, et al: Tassi di negativizzazione del radioimmunoassaggio delle IgE e del test di attivazione dei basofili nelle reazioni immediate alle penicilline. Allergia 2009; 64(2): 242-248.

PRATICA DERMATOLOGICA 2018; 28(2): 18-22