Nuove intuizioni attraverso la multiomica e il sistema di reporter biotecnologico

I metaboliti nei campioni di siero, urina e feci possono identificare quelli con insufficienza epatica acuta/cronica tra i pazienti con cirrosi epatica acuta scompensata, come base per misure diagnostiche e terapeutiche precoci. Questa è la conclusione di un progetto di studio attuale. In un progetto di un altro team di ricerca, il sistema reporter “EXSISERS” ha fornito interessanti approfondimenti sulla rilevanza dello stato di p53 nella peritonite batterica spontanea, una complicanza infettiva associata alla cirrosi epatica.

La fibrosi epatica avanzata e la cirrosi sono riassunte come “malattia epatica cronica avanzata” (ACLD). La malattia epatica cronica avanzata è caratterizzata da un danno persistente e da una crescente cicatrizzazione del fegato. Lo stadio finale della fibrosi epatica è la cirrosi epatica. I pazienti con cirrosi con scompenso acuto (AD) hanno un rischio maggiore di sviluppare un’insufficienza epatica acuta-cronica (ACLF). L’ACLF è caratterizzata da insufficienza extraepatica degli organi e infiammazione sistemica. L’ACLF è associata a un grave rischio di complicanze infettive e a un’elevata mortalità a breve termine. Per migliorare la prognosi dei pazienti colpiti, sono necessarie misure diagnostiche e terapeutiche precoci nella ACLF [1]. Dechaumet et al. hanno presentato un progetto di ricerca al congresso EASL di quest’anno, in cui sono state identificate le firme metabolomiche per differenziare i pazienti affetti da AD con o senza ACLF. [2,3]Di seguito è riportata una sintesi di questo e di un altro progetto di ricerca nel campo delle malattie epatiche avanzate.

Analisi dei dati della coorte MUCOSA-PREDICT

La totalità delle sostanze a basso peso molecolare (metaboliti) è chiamata metaboloma. Il metaboloma può essere misurato, ad esempio, mediante cromatografia, spettrometria di massa o spettroscopia di risonanza magnetica nucleare. [10]Il fegato è un organo altamente attivo dal punto di vista metabolico e le malattie del fegato sono sempre più studiate con metodi multi-omici (Fig. 1). Moreau et al. hanno riferito nel 2020 nel Journal of Hepatology di essere riusciti a identificare un’impronta digitale specifica dell’ACLF di 38 metaboliti nel sangue, utilizzando un approccio multiomico in campioni di tessuto, che si correla con l’infiammazione sistemica e agisce come indicatore della disfunzione mitocondriale negli organi periferici [4].

Obiettivi e metodologia dello studio: il progetto di Dechaumet et al. mirava a, (i) indagare se l’analisi dei metaboliti nei campioni di urina e di feci abbia un valore aggiunto per la caratterizzazione del metaboloma nei pazienti cirrotici scompensati e (ii) valutare come la metabolomica multi-matrice contribuisca a migliorare la stratificazione dei pazienti con cirrosi scompensata [2]. A tal fine, i ricercatori hanno analizzato campioni di siero, urina e feci della coorte MUCOSA-PREDICT, in cui sono seguiti 93 pazienti cirrotici con scompenso acuto, utilizzando la cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione. Sono stati rilevati e identificati un totale di 402 metaboliti nelle tre matrici biologiche.

Risultati: Il maggior numero di metaboliti le cui concentrazioni sono influenzate dall’ACLF è stato osservato nei campioni di siero [2]. È interessante notare che anche le concentrazioni di alcuni metaboliti nelle urine e nelle feci, non rilevate nel siero, sono state influenzate dall’ACLF. Tuttavia, le analisi della curva ROC eseguite per le firme metabolomiche in matrici singole o combinate hanno mostrato che la firma del siero è la migliore nel discriminare tra AD e ACLF. Si tratta di una scoperta clinicamente rilevante, poiché entrambe le malattie si sovrappongono nei singoli casi, ma sono entità diverse in termini di fisiopatologia e terapia.

Implementazione del sistema di reporting “EXSISERS”.

L’asse intestino-fegato descrive le diverse interazioni tra l’intestino e il fegato, compreso lo scambio di componenti cellulari e molecolari, ed è di importanza centrale per la regolazione di processi (pato)fisiologici essenziali. I pazienti con cirrosi epatica hanno uno spessore mucoso ridotto, che facilita il contatto diretto dei batteri con le cellule epiteliali e la degradazione dei composti cellulari [5]. La traslocazione batterica è considerata una fase cruciale nella patogenesi delle infezioni batteriche [6]. Ad esempio, la traslocazione dei batteri intestinali nei linfonodi mesenterici è un evento chiave nella peritonite batterica spontanea. La peritonite batterica spontanea** è un’infiammazione del liquido ascitico che si verifica con particolare frequenza nella cirrosi epatica e può avere conseguenze gravi.

[11]** I batteri più comuni che causano la peritonite batterica spontanea sono l’Escherichia coli Gram-negativo e la Klebsiella pneumoniae e lo Streptococcus pneumoniae Gram-positivo.

Obiettivi e metodologia dello studio: secondo Ernst et al. lo stress cellulare innescato dal contatto diretto con i batteri influisce sulla famiglia di fattori di trascrizione p53, che agiscono come regolatori chiave del ciclo cellulare, dei meccanismi di riparazione e della morte cellulare (apoptosi) [3]. Nella sua forma wild-type, la p53 (wtp53) agisce come soppressore tumorale centrale [7]. Le proteine omologhe dal punto di vista strutturale e funzionale, p63 e p73, sono incluse nella famiglia di fattori di trascrizione p53. La funzione di p53 è alterata in un gran numero di tumori (mutazioni TP53). Nel loro studio, Ernst et al. hanno studiato gli effetti dei batteri dell’ascite sull’espressione delle ^{isoforme p53$} in relazione all’induzione della morte cellulare nelle cellule epiteliali. Hanno applicato un nuovo sistema reporter biotecnologico [3]. Il sistema reporter chiamato EXSISERS può tracciare l’espressione delle isoforme nel tempo nelle cellule viventi [8].

^Le isoforme sono varianti di proteine che derivano da un singolo gene.

Tre sistemi reporter di luciferasi intein specifici per l’esone (EXSISERS) sono stati integrati negli esoni 2, 4 e 7 del gene TP53. Le inteine scisse consentono la scissione dell’enzima luciferasi dal polipeptide p53, mantenendo l’integrità strutturale delle isoforme p53 [9]. Questo metodo può essere utilizzato per quantificare con precisione i rapporti delle isoforme della proteina p53 a livello cellulare. Le cellule HCT116-EXISERS sono state co-coltivate con Escherichia coli derivate dal paziente e sono stati misurati i tre gruppi principali di isoforme p53 – p53 induzione dell’arresto del ciclo cellulare a lunghezza piena, Δ40p53 induzione della morte cellulare, Δ133p53/Δ160p53 pro-proliferativo. Allo stesso tempo, è stata quantificata la morte cellulare indotta dai batteri nelle cellule HCT116 p53 wild-type e p53 knockout. Per determinare il tipo di morte cellulare è stata utilizzata la microscopia elettronica.

Risultati: La co-coltivazione di batteri derivati da pazienti con cellule HCT116-EXISERS ha portato inizialmente ad un aumento della produzione dell’isoforma p53 che induce la morte cellulare, Δ40p53, entro 15 minuti [3]. Questo è stato seguito da una diminuzione delle isoforme p53 proliferative Δ133p53/Δ160p53. Allo stesso tempo, è stata osservata l’apoptosi in risposta al contatto batterico, che ha mostrato le caratteristiche morfologiche della paraptosi, compreso il rigonfiamento mitocondriale e la vacuolizzazione citoplasmatica. Parallelamente ai cambiamenti morfologici osservati, la citometria a flusso ha confermato il danno mitocondriale e della membrana plasmatica. Il noto inibitore della paraptosi, l’acinomicina D, ha bloccato efficacemente la morte cellulare indotta dai batteri. In accordo con l’induzione misurata dell’isoforma Δ40p53, l’induzione della morte cellulare è stata significativamente ritardata da un knockout p53 mediato da CRISPR/Cas9.

Congresso: Congresso EASL 2024

Letteratura:

1. Hübener P, Braun G, Fuhrmann V: Med Klin Intensivmed Notfmed 2018; 113(8): 649-657.
2. Dechaumet S, et al: La metabolomica multicompartimentale per stratificare i pazienti cirrotici con scompenso acuto, WED-083, Congresso EASL, Milano, 5-8 giugno 2024.
3. Ernst M, et al: Cirrosi epatica e danno epiteliale – L’asse intestino-fegato nella peritonite batterica spontanea e la sua modulazione da parte di p53, WED-106, Congresso EASL, Milano, 5-8 giugno 2024.
4. Moreau R, et al: J Hepatol 2020; 72: 688-701.
5. Haderer, M. et al: Gut 2022; 71: 580-592.
6. Rayes N: Indagine sperimentale e clinica sull’influenza dei pre e probiotici sulla traslocazione batterica e sulle infezioni post-operatorie dopo la chirurgia addominale, tesi di abilitazione, 2004, https://core.ac.uk,(ultimo accesso 27/08/2024)
7. Weilbacher A: Il ruolo dello stato di p53 per la sensibilità dei tumori ai diversi attivatori di p53, Dissertazione, 2017, https://elib.uni-stuttgart.de,(ultimo accesso 27.08.2024).
8. “Nuove proteine di design rendono visibili le isoforme in modo non invasivo”, Helmholtz Monaco, 04.06.2021.
9. Truong, D-JJ, et al: Interrogazione non invasiva e ad alto rendimento dell’espressione di isoforme specifiche di un esone. Nature Cell Biology 2021, doi:10.1038/s41556-021-00678-x
10. Raja G, et al.: Recent Advances of Microbiome-Associated Metabolomics Profiling in Liver Disease: Principles, Mechanisms, and Applications. International Journal of Molecular Sciences 2021; 22(3): 1160. www.mdpi.com/1422-0067/22/3/1160#, (letzter Abruf 27.08.2024) 
11. “Peritonite batterica spontanea (SBP)”, Danielle Tholey, MD, www.msdmanuals.com/de,(ultimo accesso 27/08/2024) .

HAUSARZT PRAXIS 2024; 19(9): 38-39 (pubblicato il 18.9.24, prima della stampa)