A proteína 2, que contém o domínio LEM, é essencial para o desenvolvimento do coração

A integridade do invólucro nuclear é essencial para a compartimentação do núcleo e do citoplasma. É importante referir que as mutações nos genes que codificam o envelope nuclear e as proteínas associadas são a segunda causa mais comum de cardiomiopatia dilatada familiar. Uma dessas proteínas NE que causa cardiomiopatia em humanos e influencia o desenvolvimento do coração em ratos é a Lem2.

(vermelho) Nas células eucarióticas, o invólucro nuclear (NE) separa os compartimentos nuclear e citoplasmático. Por baixo da NE encontra-se a lâmina nuclear, que é constituída pelas laminas A/C, B1 e B2 [2]. Pensa-se que a lâmina nuclear confere rigidez estrutural ao núcleo e desempenha um papel na ligação da cromatina e na regulação da expressão genética [3,4]. O NE está intercalado com o complexo LINC (Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton), que atravessa a membrana dupla [5–7]. Nos músculos estriados, como o coração, o complexo LINC e as suas proteínas associadas demonstraram ser essenciais para o funcionamento normal [8–13]. Associadas ao complexo LINC estão as proteínas que contêm os domínios lamina-associated peptide 2 (Lap2), emerin e MAN1 (LEM), que também desempenham um papel importante no coração. De facto, as mutações nos genes Emerin, Lap2 e LEM domain-containing 2 (Lem2) estão associadas à distrofia muscular de Emery-Dreifuss com perturbações da condução cardíaca, à cardiomiopatia dilatada e à cardiomiopatia arritmogénica (CA), respetivamente [14–18]. Em particular, uma mutação de leucina-13 para arginina (L13R) em Lem2 leva a AC e morte súbita [16,17]. Além disso, uma mutação no terminal C que altera a serina 479 para fenilalanina (S479F) conduz ao bloqueio do ramo direito e à hipertrofia do septo [18].

Pensa-se que o Lem2 desempenha um papel in vitro e em organismos inferiores. Estas vão desde a reparação da NE e a recapagem após a mitose até à manutenção da forma nuclear, à regulação da heterocromatina e da expressão genética e à regulação da sinalização da proteína quinase activada por mitogénio (MAPK) [19–27]. Nos ratinhos, a perda global de Lem2 resultou em letalidade embrionária entre E10.5 e E11.5, com um tamanho corporal total significativamente menor e a maioria dos tecidos [28]. Os defeitos de desenvolvimento mais específicos incluíam a diminuição da neurogénese nos tecidos neuronais e paredes miocárdicas mais finas no coração. No entanto, o papel específico que o Lem2 desempenha no coração ainda não é suficientemente conhecido.

Lem2 é essencial para o desenvolvimento normal do coração

Para investigar o papel do Lem2 na função cardíaca, um estudo recente [1] gerou ratinhos knockout específicos para cardiomiócitos, designados Lem2 cKO, utilizando uma abordagem Cre-LoxP. A ablação de Lem2 foi confirmada por Western blotting (WB) e análises de imunofluorescência. A maioria dos ratinhos Lem2 cKO não sobreviveu até ao dia embrionário 18.5 (E18.5), indicando letalidade em fases fetais tardias. A biópsia de tecido na E18.5 revelou que os corações Lem2 cKO eram mais pequenos e tinham átrios alargados nos quais o sangue se acumulava, indicando uma função cardíaca anormal. Para investigar melhor este aspeto, foi efectuada uma microscopia episcópica de alta resolução (HREM) para a reconstrução de órgãos em 3D e análises morfológicas [29]. Surpreendentemente, não foram observados defeitos congénitos óbvios que envolvessem um desenvolvimento ventricular anormal, o que explicava a morte fetal nos ratinhos Lem2 cKO. No entanto, a espessura da parede dos ventrículos foi ligeiramente reduzida em E14.5, o que foi ainda mais pronunciado em E16.5 e indica um atraso no desenvolvimento. No entanto, não foram detectadas alterações na organização trabecular, que foi realizada utilizando análises fractais em dados HREM na E16.5 para quantificar a complexidade morfológica.

A ablação de Lem2 ativa a morte celular e inibe as vias de desenvolvimento cardíaco

Para avaliar melhor as alterações no desenvolvimento do coração, foi realizada uma análise de sequenciação de ARN na E14.5 em corações inteiros de controlo e Lem2 cKO. A expressão genética diferencial mostrou alterações ligeiras mas significativas na expressão genética, com 92 e 49 genes a serem significativamente regulados para cima e para baixo, respetivamente (Fig. 1A) [1]. A análise Gene Ontology (GO) revelou um enriquecimento significativo da morte celular apoptótica e uma redução nos processos importantes para o desenvolvimento cardíaco adequado, incluindo os envolvidos na morfogénese, contração e condução (Fig. 1B, C e F) [1]. Os genes regulados positivamente incluem Gadd45b e Gadd45g, que estão associados à morte celular [30,31], bem como Fos, Spp1 e Arrdc3. Os genes regulados negativamente incluem Rnf207, Kcnq1 e Cacng6, que estão associados à condução e contração cardíacas, e Adamts6, que regula a morfogénese cardíaca [32–35] (Fig. 1G e H) [1]. Estas alterações foram detectadas tanto ao nível do ARNm como das proteínas (Fig. 1E e H) [1], demonstrando que o Lem2 é necessário para a viabilidade celular e essencial para a expressão genética normal durante o desenvolvimento do coração.

A perda de Lem2 leva à apoptose dos cardiomiócitos, à acumulação de danos no ADN e a danos nos micronúcleos.

Para testar se a via de morte celular regulada em alta conduz à apoptose, os corações foram marcados para a caspase 3 clivada, o que confirmou um elevado nível de apoptose nos corações Lem2 cKO entre E13.5 e E16.5, consistente com os resultados em tubos neurais de ratinhos Lem2 KO globais [28]. Consequentemente, foi observada uma redução de ~41% no número de cardiomiócitos isolados de corações E14.5 de cKO em comparação com os controlos (média ± DP: 94 500 ± 25 500 vs. 159 900 ± 34 700 cardiomiócitos).

Estes resultados foram confirmados por um modelo independente no qual a expressão de Cre foi conduzida pelo promotor da troponina T cardíaca (cTnT) para gerar corações Lem2f/f; cTnT-Cre/+ cKO [36]. Dado que Lem2 é um regulador da sinalização MAPK [28], estas vias foram examinadas e verificou-se que os corações Lem2 cKO apresentavam níveis elevados de ativação de ERK1/2 mas não de p38. Os corações Lem2 cKO apresentaram níveis aumentados de γH2AX (que marca as quebras de cadeia dupla do ADN) [37] e micronúcleos em E14.5 e E16.5.

O desenvolvimento do coração é estritamente regulado e requer um equilíbrio preciso entre a proliferação e a apoptose. Por conseguinte, a coloração com EdU e anti-fosfo-histona H3 foi utilizada para marcar as células em síntese de ADN e em mitose, respetivamente. As taxas de proliferação entre os genótipos eram comparáveis.

Os núcleos dos cardiomiócitos que não possuem Lem2 têm uma forma anormal e são mais susceptíveis à rutura mecânica

Depois de se ter observado um aumento da apoptose, dos danos no ADN e dos micronúcleos in vivo, os cardiomiócitos foram colocados em hidrogéis macios de PDMS a uma pressão de 6 kPa para imitar a rigidez do coração in vivo [38–40]. Foi observada uma forma nuclear diferente e uma área nuclear aumentada nos cardiomiócitos E14.5 Lem2 cKO em comparação com as células de controlo (Fig. 2A-C) [1].

Para avaliar a integridade da NE e observar se ocorre um processo semelhante nos cardiomiócitos Lem2 cKO, a guanosina monofosfato adenosina monofosfato sintase cíclica (cGAS) cataliticamente inativa, ligada a uma etiqueta fluorescente mScarlet, foi expressa transitoriamente em cardiomiócitos Lem2 cKO para marcar a exposição da cromatina citoplasmática e, por conseguinte, os eventos de rutura nuclear [41,42]. Foi observada uma incidência significativamente maior de rutura nuclear nas células Lem2 cKO em comparação com as células de controlo, demonstrando um papel importante de Lem2 na manutenção da integridade nuclear (Fig. 2D) [1]. Foram efectuadas observações semelhantes quando as células foram colocadas em vidro, que é muito mais rígido do que o hidrogel (Fig. 2B-D) [1].

Foi demonstrado anteriormente que as cGAS estão associadas à cromatina depois de o NE ter sido colapsado durante a mitose e de o NE não ter sido novamente selado após a mitose [43-45], o que pode contribuir para as quantidades de cGAS observadas no NE. Para determinar se a acumulação de cGAS no NE se deve à rutura durante a interfase (NERDI) ou a uma selagem defeituosa do NE após a mitose [46]Foram realizadas imagens de células vivas durante a noite em cardiomiócitos que expressam cGAS e a frequência de acumulação de cGAS no NE foi monitorizada em cardiomiócitos que não sofreram mitose. Foram observados valores elevados de NERDI (~8 e ~1%) para Lem2 cKO durante 16 horas em comparação com os controlos (Fig. 2E) [1]. Como prova adicional de que a acumulação de cGAS no NE é em grande parte o resultado de NERDIs, os cardiomiócitos foram transduzidos com BAF-GFP como marcador de cicatrizes NERDI [46]. No Lem2 cKO, observou-se um aumento significativo da localização de BAF no NE em comparação com o controlo, o que faz lembrar os dados do cGAS. Em consonância com este facto, foi observada uma concordância de quase 100% da localização de BAF com cGAS em focos NE.

A inibição da contração muscular enfraquece os defeitos de forma e as rupturas dos núcleos

Uma vez que os núcleos dos cardiomiócitos estão sujeitos a um stress mecânico constante através do complexo LINC, que transmite a força dos sarcómeros para o esqueleto nuclear, os cardiomiócitos foram tratados com para-nitroblebistatina, que inibe a miosina e pára a contração muscular [47]. Este agente foi capaz de atenuar completamente os defeitos do molde nuclear e as rupturas (Fig. 2F-J) [1].

Uma vez que a para-nitroblebistatina é um inibidor geral da família da miosina de classe II, a contração muscular foi especificamente inibida por um mecanismo diferente, utilizando o verapamil, um fármaco clinicamente utilizado que inibe os canais de cálcio dependentes da voltagem para afetar o acoplamento excitação-contração. Da mesma forma, o verapamil também foi capaz de salvar completamente as formas aberrantes e as fissuras nos núcleos dos cardiomiócitos (Fig. 2F-J) [1] [48,49]. Para testar ainda se a integridade dos núcleos é afetada pela contração muscular, foi utilizado um ativador da miosina cardíaca (Omecamtiv mecarbil) para estimular a contração muscular. Após estimulação da contração muscular, observou-se um aumento da rutura nuclear nos núcleos Lem2 cKO (Fig. 2G, H, J) [1]. De facto, foi detectado um aumento dos danos no ADN nos cardiomiócitos cKO em comparação com os controlos, o que pode ser revertido através da inibição da contração muscular (Fig. 2K) [1]. Estes resultados indicam que o Lem2 nos cardiomiócitos é essencial para a manutenção da NE e da integridade do genoma sob o stress mecânico causado pelas forças de contração muscular. No entanto, análises detalhadas de WB e imunofluorescência não mostraram diferenças detectáveis na maioria das proteínas NE e da lâmina entre os genótipos.

Não se observam defeitos óbvios na função cardíaca dos ratinhos Lem2-iCKO

Após a descoberta de que o Lem2 é essencial nos cardiomiócitos fetais, surgiu a questão de saber se também desempenha um papel semelhante nos adultos. Por conseguinte, após ter sido detectada a expressão de Lem2 em cardiomiócitos adultos utilizando células isoladas e fatias de coração (Fig. 3A e B) [1], foram gerados ratinhos Lem2 inducible conditional knockout (iCKO) utilizando uma linha de ratinho Cre específica para cardiomiócitos induzida por tamoxifeno Tnnt2MerCreMer/+ [50].

Foram efectuadas ecocardiografias às oito semanas de idade e antes da ablação de Lem2 às nove semanas de idade, seguidas de ecocardiografias seriadas às 33, 48 e 83 semanas de idade. A função cardíaca e a espessura da parede dos ratinhos Lem2 iCKO eram comparáveis às dos ratinhos de controlo em todas as medições e em todas as idades (Fig. 3C-E) [1]. Não foram observadas alterações nos níveis de expressão do programa genético fetal e dos marcadores pró-fibróticos por análise quantitativa de RT-PCR, indicando que não houve remodelação adversa ou fibrose.

Para além das análises ecocardiográficas e de expressão génica, a análise histológica não revelou evidência de defeitos morfológicos, alterações na deposição de matriz extracelular ou alterações no tamanho dos miócitos (Fig. 3F) [1]. Além disso, também não se verificaram alterações na relação entre o peso do coração e o comprimento das costelas e entre o peso do coração e o peso corporal nos ratinhos Lem2 iCKO, em comparação com os ratinhos de controlo. Estes dados sugerem que a remoção do Lem2 não afecta a função cardíaca até às 83 semanas de idade, quando o coração do rato adulto está completamente desenvolvido.

A maioria dos níveis de proteína NE não é alterada nos corações Lem2 iCKO e nos cardiomiócitos isolados

Dada a ausência de fenótipo básico nos ratinhos Lem2 iCKO, colocou-se a hipótese de outras proteínas NE poderem compensar a Lem2, tal como demonstrado anteriormente noutros sistemas [51,52]. Para testar isto, foram realizados WBs em corações inteiros de ratinhos controlo e Lem2 iCKO e analisados para uma gama de proteínas NE e da lâmina (Fig. 3G) [1]. Como esperado, a concentração de Lem2 em Lem2 iCKO foi reduzida para 46% da concentração de controlo. As outras proteínas não sofreram alterações, com exceção da proteína SUN2 do complexo LINC, que aumentou 1,5 vezes em comparação com o controlo (p<0,01).

Os níveis de imunofluorescência e a localização da maioria das proteínas NE não foram alterados, com exceção da Lem2, que foi significativamente reduzida nos cardiomiócitos iCKO, e um ligeiro aumento da SUN2, o que foi consistente com os WBs. Os níveis de transcrição do ARNm de Sun2 (bem como de outros componentes do complexo LINC) foram semelhantes entre os genótipos, sugerindo que o aumento de SUN2 observado nos cardiomiócitos Lem2 iCKO é provavelmente regulado a nível proteico e não a nível da expressão genética.

A integridade nuclear e a rigidez não são afectadas nos cardiomiócitos adultos Lem2 iCKO

Análises abrangentes 2D e 3D dos núcleos dos cardiomiócitos não revelaram diferenças nos parâmetros de forma entre os genótipos. Curiosamente, no entanto, foram observadas invaginações da NE/lamina tanto nos controlos como nos ratinhos iCKO, mas numa extensão semelhante em ambos os genótipos.

Trabalhos anteriores mostraram que as mutações nos parceiros de interação de Lem2, as laminas A e C, influenciam a rigidez do núcleo e tornam os núcleos mais deformáveis sob tensão mecânica [4]. Para testar se este é também o caso com Lem2 iCKO, foi realizada nanoindentação em cardiomiócitos adultos de Lem2 iCKO e de ratinhos de controlo. O módulo de elasticidade calculado mostrou rigidezes do núcleo comparáveis entre Lem2 iCKO e os ratos de controlo (1,01 e 1,26 kPa, respetivamente). O Lem2 não é, portanto, necessário para a morfologia e mecânica nucleares normais nos cardiomiócitos de ratos adultos.

A forma nuclear é mantida em resposta ao aumento da pressão nos cardiomiócitos adultos Lem2 iCKO

Dada a ausência de fenótipo básico nos cardiomiócitos Lem2 iCKO, os núcleos foram em seguida submetidos a stress em cardiomiócitos Lem2 iCKO vivos. Para este efeito, foram isolados cardiomiócitos adultos de Lem2 iCKO ou de controlos de companheiros de ninhada e expostos a pressões hidrodinâmicas. Estes correspondiam aos observados em corações saudáveis, normais ou pressurizados in vivo, utilizando um estimulador de pressão (CellScale MechanoCulture TR; modificado para uma gama de pressão baixa [53]) [54].

Cardiomiócitos adultos de Lem2 iCKO e controlos de estimulação oscilatória foram submetidos a pressão normal (120/15 mmHg) ou alta (200/30 mmHg) e foram realizadas análises da forma nuclear. Curiosamente, os núcleos dos cardiomiócitos de ambos os genótipos responderam de forma semelhante à pressão elevada e tornaram-se mais irregulares e menos circulares, conforme medido pela circularidade, firmeza e relação de aspeto dos núcleos. No entanto, não foram observadas alterações na forma nuclear entre as células Lem2 iCKO e as células de controlo.

Nos cardiomiócitos adultos que se adaptaram às exigências físicas da NE, a remoção de Lem2 parece não ter qualquer efeito na função cardíaca ou na forma nuclear. Lem2 não é necessário para manter a forma nuclear sob alta pressão em cardiomiócitos adultos. No entanto, não se pode excluir que o Lem2 remanescente nos corações Lem2 iCKO seja suficiente para manter a função do Lem2 neste papel.

Uma visão da cardiomiopatia das mutações do Lem2 e da cardiomiopatia de
Laminopatias

Os resultados do estudo sugerem que o Lem2 é crucial para a integridade do NE em desenvolvimento no coração fetal e protege o núcleo das forças mecânicas da contração muscular. Em contraste, o coração adulto não é afetado de forma detetável pela depleção parcial de Lem2, possivelmente devido a uma NE melhor estabelecida e a uma maior adaptação ao stress mecânico. Estes dados fornecem informações sobre os mecanismos subjacentes à cardiomiopatia em doentes com mutações Lem2 e cardio-laminopatias.

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