Novas formas de tratamento

A terapia genética, a esperança de longa data da investigação médica, está finalmente a encontrar o seu caminho na clínica para curar doenças monogenéticas. Assim, a medicina tem à sua disposição uma nova terapia que pode tratar as doenças hereditárias não só de forma sintomática mas também causal. Outra abordagem de terapia genética é o tratamento de alterações genéticas adquiridas em tumores malignos usando células T CAR (receptor de antígeno quimérico).

Genes como plantas de todas as proteínas – mutações como causa de doenças monogénicas

Cada célula humana contém uma planta genética dentro do núcleo celular sob a forma de ácido desoxirribonucleico (ADN). O ADN é constituído por quatro blocos básicos de construção, as bases adenina (A), timina (T), guanina (G) e citosina (C), que, alinhadas em longas cadeias lineares, formam a estrutura básica dos cromossomas de uma célula humana. O ADN de cada célula contém unidades codificadoras individuais, os genes. Cada gene consiste numa região codificadora e numa unidade reguladora, o promotor, cuja actividade pode ser amplificada por um elemento potenciador, se necessário. Cada gene codifica a estrutura de uma proteína através da sequência dos quatro blocos básicos de construção do ADN. As proteínas são compostas por 20 blocos de construção básicos, os aminoácidos, que se dobram em uma ou mais cadeias lineares para formar proteínas. Apenas proteínas devidamente dobradas podem desempenhar a sua função biológica na célula.

Doenças monogenéticas

Se ocorrer uma reparação defeituosa após danos no ADN, a sequência dos blocos básicos de construção do ADN pode ser alterada. Alternativamente, os blocos básicos de construção de ADN também podem ser perdidos. Estas alterações são chamadas “mutações”. Se ocorrer uma mutação numa secção do ADN que codifica uma proteína, isto pode alterar a estrutura da proteína aí codificada: A proteína defeituosa sintetizada de acordo com o plano do ADN não pode cumprir a sua função natural na célula ou só o pode fazer de forma incompleta. Esta alteração genética, no caso mais simples, por exemplo, uma troca de um A por um C dentro do ADN, pode ser a causa causal de uma doença genética, se a função da célula num tecido for reduzida ou mesmo falhar como resultado, por exemplo

Quando o metabolismo nas células funciona insuficientemente e os metabolitos se acumulam (por exemplo, defeito da lipoproteína lipase).
Quando a síntese de blocos de construção básicos individuais pelo metabolismo é deficiente (por exemplo, defeito de glucose-6-fosfato desidrogenase).
Se componentes individuais do sistema imunitário não funcionarem (por exemplo, Granulomatose Séptica ou Imunodeficiência Combinada Grave).

Num estudo recente, 4166 doenças raras e monogenéticas poderiam estar causalmente ligadas a 3163 genes [1]. Uma cura para a doença com uma causa genética só é possível se for possível compensar ou corrigir a causa causal.

Novas abordagens para a cura através da terapia genética

Se uma mutação genética claramente definida tiver sido identificada como a causa de uma doença, esta doença torna-se acessível para uma potencial terapia genética. Estão disponíveis vários procedimentos:

Nas doenças em que a mutação genética leva à perda de expressão de proteínas ou à expressão de uma proteína defeituosa (“perda de função” ou mutações “disfuncionais”), a adição de genes pode ser realizada.
Nas doenças em que a mutação genética leva a uma sobrefunção da proteína (mutações de “ganho de função”), pode ser tentada a reparação genética.

Além disso, o genoma da célula é estendido por um gene que codifica correctamente a proteína em falta ou em mau funcionamento e assim compensa a função do gene mutado. Isto resulta numa restauração da função original da proteína. A adição de genes tem sido testada em ensaios clínicos para o tratamento de numerosas doenças, com sucesso clínico para mais de 20 doenças hereditárias congénitas. Todos os produtos de terapia genética actualmente aprovados são baseados na adição de genes.

Na reparação de genes com nucleases como o CRISPR-Cas9 (fusão do Cas9 de nuclease com o CRISPR, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), a sequência de ADN correcta é restaurada na célula, visando a mutação e corrigindo a mutação in situ (princípio: recortar e substituir). Assim, a função pretendida da proteína é restaurada e, subsequentemente, há uma normalização da função biológica. A utilização da reparação genética (“tesoura genética”/CRISPR-Cas) é possível independentemente da presença de mutações “ganho de função” ou “perda de função”. Tal modificação de informação genética específica da sequência é possível no laboratório, mas até agora só tem sido utilizada em oncologia no contexto de alguns poucos ensaios clínicos.

Genaddition

Os primeiros sucessos clínicos através da terapia genética foram alcançados no campo da imunologia. As causas das imunodeficiências congénitas residem nas células estaminais hematopoiéticas. Os doentes afectados podem, portanto, ser curados através do transplante de células estaminais hematopoiéticas de um dador não relacionado ou familiar (transplante alogénico). Os membros da família são raramente utilizados como doadores de HLA-haploidentical devido a uma taxa mais elevada de efeitos secundários. Os membros da família que têm uma identidade HLA mais elevada, mas que também são portadores do defeito genético, são mais susceptíveis de ser inelegíveis. Na ausência de um doador idêntico ao HLA (em cerca de 1/3 dos caucasianos, mais frequentemente noutros grupos étnicos), a terapia genética autóloga pode levar a uma cura da doença.

Para a terapia genética ex vivo, as células autólogas são esféricas após a mobilização com G-CSF, purificadas, enriquecidas e cultivadas ex vivo durante um curto período de tempo. Durante este período, as células estaminais são tratadas com o vector da terapia genética e depois reinfundidas no paciente, geralmente após quimioterapia para abater a medula óssea. Surpreendentemente, dependendo da imunodeficiência, a correcção parcial pode ser suficiente para uma melhoria clínica significativa.
A primeira publicação sobre terapia genética bem sucedida apareceu em 2000 sobre o tratamento de bebés com a forma mais grave de imunodeficiência congénita, imunodeficiência combinada grave, que geralmente leva à morte sem transplante no primeiro ano de vida devido às infecções mais graves [2].

Entre 2000 e 2006, todos os sucessos clínicos no campo da terapia genética foram alcançados com a ajuda dos chamados vectores retrovirais. Estes introduzem a sequência de correcção sob a forma de RNA nas células estaminais, onde é convertida em ADN por transcrição inversa e depois integrada no ADN do paciente (adição de genes). Posteriormente, formam-se proteínas funcionais e assim o defeito é clinicamente corrigido.

Para uma adição de genes in vivo, as células do corpo não são removidas, tratadas e devolvidas, mas as partículas virais com sequência de correcção são injectadas directamente no corpo. A primeira adição de genes in vivo foi publicada em 2007: para o tratamento da doença de Parkinson, os doentes foram injectados unilateralmente, subthalamicamente, com partículas virais adeno-associadas (AAV) modificadas que codificavam a descarboxilase do ácido glutâmico [3]. A grande maioria dos ensaios clínicos de terapia genética in vivo utiliza partículas modificadas de AAV para fornecer informação genética ao organismo. As excepções são o uso do vírus do herpes simples-1 modificado (HSV-1)- partículas virais derivadas do vírus [4] ou partículas adenovirais não replicantes [5] para o tratamento do glioblastoma e o teste de partículas virais derivadas do HIV-1 para o tratamento in vivo da doença de Parkinson [6].

Efeitos secundários nos primeiros estudos de terapia genética

Na primeira geração de terapias génicas ex vivocom vectores retrovirais γ, foi demonstrado que o sítio de integração do vector de terapia genética no genoma da célula alvo desempenha um papel fundamental no que diz respeito a possíveis efeitos secundários. Estes vectores de primeira geração integram preferencialmente sítios de início de transcrição próximos. Na primeira geração γ-retroviral de vectores da terapia genética, a expressão proteica foi impulsionada por um promotor no vector da terapia genética e melhorada por um melhorador. O melhorador do vector de terapia genética da primeira geração foi capaz de interagir com o sítio de início da transcrição do gene no qual o vector de terapia genética foi integrado. Se a integração num oncogene tivesse lugar, este oncogene poderia ser activado para além da expressão terapêutica da proteína, o que levou à cura da doença subjacente. Como resultado, as células estaminais em que esta constelação ocorreu tinham adquirido uma vantagem de crescimento e eram capazes de se multiplicar clonalmente. Em alguns ensaios clínicos com várias imunodeficiências, isto resultou em alguns doentes desenvolverem malignidades hematológicas como um efeito secundário da terapia genética [7–10]. Estes efeitos secundários levaram a uma mudança de vectores retrovirais γ para vectores lentivíricos derivados do vírus HIV-1 a partir de 2009, uma vez que o seu perfil de integração promete mais segurança [11]. Além disso, nos chamados vectores de auto-inactivação lentiviral (SIN), o promotor derivado do vírus HIV-1 e o seu elemento melhorador foram removidos. A ausência de elementos melhoradores nos vectores da segunda e terceira gerações de terapia genética impede a transacção de oncogenes mediada por melhoradores após tratamento ex vivo dascélulas estaminais. Até à data, os ensaios clínicos trataram as células estaminais de aproximadamente 100 pacientes com vectores de SIN lentiviral. Até agora, nenhum destes ensaios clínicos resultou no desenvolvimento de malignidades hematológicas, indicando uma melhoria significativa da segurança em comparação com o vector da primeira geração.

Os vectores de terapia genética baseados em AAV utilizados para a adição de genes in vivosó se integram em pequena medida no genoma das células alvo. Por conseguinte, a mutagénese de inserção é improvável. O maior potencial de risco dos vectores de terapia genética baseados em AAV reside em qualquer imunidade pré-existente às estruturas de superfície do vector AAV. Num ensaio clínico para o tratamento da hemofilia B, foi utilizado intramuscularmente um vector AAV2 codificador de factor de coagulação do sangue IX. Uma resposta imunitária mediada por células T levou à eliminação de todas as células geneticamente modificadas e pôs fim ao efeito terapêutico [12]. Em contraste, a administração intravenosa resultou na absorção dos vectores em hepatócitos e efeitos terapêuticos a longo prazo em doentes nos quais não foi possível detectar anticorpos contra AAV antes da inclusão no estudo [13].

Sucessos da terapia genética

A primeira geração de vectores de terapia genética γ-retroviral forneceu provas de que a terapia genética pode levar ao sucesso clínico da X-SCID (imunodeficiência combinada grave ligada ao X) [2], ADA (adenosina deaminase)-SCID [14], X-CGD (granulomatose séptica ligada ao X) [9], epidermólise bolhosa [15] e para a síndrome de Wiskott Aldrich (WAS) [16].

Devido aos efeitos secundários acima mencionados no tratamento de X-SCID, X-CGD e WAS com vectores de terapia genética de primeira geração (γ-vectores retrovirais com promotor/reforçador completo), foram desenvolvidos vectores de SIN lentiviral, levando a uma história clínica de sucesso. Até agora, os vectores do SIN lentiviral alcançaram sucesso clínico na terapia genética ex vivo para o tratamento de

Adrenoleucodistrofia ligada ao X (ALD) [17]
γ-Thalassemia [18,19]
O QUE [20]
X-SCID [21]
ADA-SCID [22]
Doença das células falciformes [23]
COL7A1 Epidermólise Bullosa [24]
Leucodistrofia metacromática [25]

Entretanto, a terapia genética in vivomediada por AAV também tem sido utilizada no tratamento de pelo menos 14 indicações:

Neurologia

Parkinson [3,26,27]

Oftalmologia

Congregação do fígado. Amaurose [28,29]
Chorioideremia [30,31]
Degeneração macular relacionada com a idade [32]
A neuropatia óptica hereditária de Leber [33,34]

Hematologia

Hemofilia B [13]

Distrofia muscular

Distrofia muscular Becker [35]
Atrofia muscular espinhal tipo I (SMA1) [36]

Doenças metabólicas

Doença de Pompe [37]
α-1-antitripsina (AAT) deficiente [38,39]
Mucopolissacaridose tipo IIIB [40]
Deficiência de descarboxilase de aminoácidos aromáticos [41,43]
Deficiência de lipoproteína lipase [42]

No tratamento da leucemia, as células CAR-T são utilizadas em numerosos estudos e agora também em terapias aprovadas. Para este fim, os receptores quiméricos de antigénios são introduzidos em células T autólogas de doentes afectados. Isto permite que estas células T geneticamente modificadas (células CAR-T) reconheçam e eliminem células tumorais [44–46].

Reparação de género

Até agora, não tem sido possível ter vectores de terapia genética lenti- ou γ-retroviral integrados em sítios pré-determinados do genoma. A inserção e/ou correcção específica da sequência só se tornou possível depois de ter sido possível cortar o ADN de uma forma específica da sequência. Isto é feito usando nucleases como o CRISPR-Cas. Neste sistema de terapia genética, foi produzida uma fusão das Repetições Palindrómicas Curtas Interespaçadas Regularmente (CRISPR) e do Cas9 de corte de ADN (CRISPR/Cas9) [47]. A quebra resultante no ADN pode então ser reparada pela célula de duas maneiras diferentes: Ou as extremidades são reconectadas num processo defeituoso chamado de junção final não-homológica. O segundo mecanismo de reparação é a recombinação homóloga. Este caminho é tomado quando há ADN reparado na célula cujas extremidades coincidem com a sequência de ADN no local da quebra de ADN. Este ADN reparador é administrado às células juntamente com o nuclease e serve como modelo genético. Na recombinação homóloga, a quebra do ADN é então fechada pelas enzimas de reparação celular endógena de acordo com a sequência de ADN do ADN de reparação. Isto torna possível introduzir um gene de correcção no genoma de uma forma específica de sequência ou corrigir geneticamente mutações pontuais. A adição de genes específicos da sequência ainda não encontrou aplicação clínica porque a eficiência do método tem sido limitada até agora. Contudo, os recentes desenvolvimentos técnicos estão a trazer os ensaios clínicos para o reino da possibilidade.

Produtos de terapia genética clinicamente aprovados

O tratamento de pacientes com produtos de terapia genética é possível em centros especializados. Vários produtos já receberam autorização de comercialização (Tab. 1).

Mensagens Take-Home

A terapia genética como tratamento causal para doenças hereditárias monogenéticas está cada vez mais a encontrar o seu caminho para a clínica.
Utilizando vectores virais, a terapia genética baseada na adição de genes tem sido utilizada com sucesso em ensaios clínicos para certas doenças hematológicas desde 2000.
doenças e imunodeficiências congénitas.
Até à data, a reparação de genes alvo usando nucleases tem sido utilizada em poucos estudos para doenças oncológicas em que a função de um gene deve ser desligada.
Algumas doenças podem ser tratadas utilizando células T geneticamente modificadas (células CAR-T).
A terapêutica genética já está actualmente disponível como produtos aprovados para 7 doenças.

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