PTX3 contribuisce alle complicazioni cardiache indotte da trastuzumab

Trastuzumab, il primo anticorpo monoclonale umanizzato che ha come bersaglio il recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano (ERBB2/HER2), è attualmente utilizzato come terapia di prima linea per i tumori HER2(+). Tuttavia, il trastuzumab aumenta il rischio di complicazioni cardiache senza influenzare la struttura del miocardio, suggerendo un meccanismo diverso di cardiotossicità.

Trastuzumab, un anticorpo monoclonale umanizzato ampiamente utilizzato, che ha come bersaglio il recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano (HER2), mostra effetti terapeutici in clinica contro i tumori che esprimono HER2. Tuttavia, il trastuzumab è strettamente associato al rischio di complicazioni cardiovascolari. Un totale del 2–16% dei pazienti trattati con trastuzumab subisce una diminuzione della frazione di eiezione ventricolare sinistra e l’1–4% dei pazienti finisce per sviluppare un’insufficienza cardiaca sintomatica [2–4], il che limita fortemente l’uso sicuro di trastuzumab nella pratica clinica. Inoltre, non è stato osservato alcun danno miocardico significativo nei campioni di biopsia endomiocardica di pazienti con cardiotossicità da trastuzumab [5], suggerendo un meccanismo cardiotossico complicato.

HER2 svolge un ruolo chiave nello sviluppo e nella funzione del cuore

L’inibizione della segnalazione di HER2 porta al danno dei cardiomiociti durante l’invecchiamento e il sovraccarico di stress, con conseguente diminuzione della sopravvivenza dei cardiomiociti. Questo suggerisce che HER2 è fondamentale per la sopravvivenza dei cardiomiociti e la funzione cardiaca. Tuttavia, non è stato osservato alcun cambiamento significativo nella morte mitocondriale o dei cardiomiociti nei topi adulti con carenza di HER2 ventricolare [7]. In effetti, l’espressione complessiva di HER2 nei cuori di topo diminuisce con l’età [8], ma non è stata dimostrata l’espressione e la funzione di HER2 nei diversi tipi di cellule del cuore adulto.

Gli studi clinici hanno dimostrato che i pazienti con malattia vascolare preesistente sono più suscettibili alle complicazioni cardiovascolari indotte dal trastuzumab [2,9], suggerendo che il sistema vascolare può contribuire alla cardiotossicità legata al trastuzumab. Le cellule endoteliali vascolari (VEC) sono un fattore importante per mantenere la funzione contrattile dei cardiomiociti. Rilasciano molecole di segnalazione che regolano la risposta sistolica dei cardiomiociti [10,11]. Pertanto, l’inibizione di HER2 nelle VEC potrebbe essere una delle cause della disfunzione cardiaca indotta da trastuzumab. Tuttavia, l’espressione e la funzione di HER2 nelle VEC del cuore adulto rimangono sconosciute.

Uno studio pubblicato di recente ha dimostrato che l’espressione di HER2 è più elevata nelle VEC adulte rispetto ai cardiomiociti e ha identificato le VEC come le principali cellule bersaglio di trastuzumab. La pentrassina 3 (PTX3) delle VEC è stata trovata per ridurre la contrattilità dei cardiomiociti, inibendo la segnalazione del calcio. Inoltre, è stato dimostrato che STAT3 funziona come fattore di trascrizione di PTX3 e l’asse di segnalazione EGFR-STAT3 nelle VEC ha aumentato la trascrizione e il rilascio di PTX3. Il lapatinib, un doppio inibitore dell’EGFR e dell’HER2, è stato trovato anche in grado di abolire il declino della funzione LV indotto dal trastuzumab, suggerendo una strategia protettiva contro la cardiomiopatia indotta dal trastuzumab e fornendo un razionale per l’uso combinato di lapatinib e trastuzumab nella terapia del cancro [1].

Le VEC mediano la cardiotossicità indotta da trastuzumab

Per identificare il meccanismo cardiotossico del trastuzumab, è stato prima studiato l’effetto diretto del trastuzumab sui cardiomiociti. I risultati hanno mostrato che il trastuzumab non ha ridotto la sopravvivenza dei cardiomiociti. È stato creato un modello per rilevare la forza contrattile delle cellule, basandosi sulla letteratura [13] e utilizzando la digossina, che può promuovere la contrazione delle cellule e ridurre la superficie planare. L’area della superficie planare delle cellule è risultata ridotta dopo la somministrazione di digossina sia nel gruppo di controllo che in quello di trastuzumab, suggerendo che il trastuzumab non ha effetti deleteri diretti sulla contrazione dei cardiomiociti. Inoltre, è stato utilizzato il modello iPSC-CM umano e le iPSC-CM sono state trattate con trastuzumab o adriamicina (ADR), un farmaco antitumorale che può ridurre la sopravvivenza e la contrattilità dei cardiomiociti, per generare un gruppo di controllo positivo. Dopo sei ore di trattamento con ADR, il tasso di sopravvivenza delle cellule è diminuito in modo significativo. A differenza dell’ADR, il trastuzumab non ha ridotto significativamente la sopravvivenza delle cellule. Le osservazioni illustrano che l’ampiezza della contrazione spontanea e la frequenza dei battiti non sono state influenzate dal trattamento con trastuzumab, ma sono state ridotte dal trattamento con ADR.

Per confermare l’effetto di trastuzumab sul cuore, è stato creato un modello di ratto con anticorpo anti-HER2/neu (omologo di HER2 nei ratti). L’anticorpo anti-HER2/neu e il trastuzumab condividono la somiglianza strutturale nella terza regione che determina la complementarità e hanno lo stesso epitopo antigenico sui loro bersagli [14]. La colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) non ha mostrato alcun danno cardiaco evidente nei cuori dei ratti trattati con l’anticorpo anti-HER2/neu. L’aumento della deposizione di collagene è stato osservato nelle sezioni cardiache dei ratti trattati con anticorpi anti-HER2/neu. La colorazione con agglutinina di germe di grano (WGA) ha mostrato un leggero aumento delle dimensioni dei cardiomiociti nei cuori dei ratti trattati con l’anticorpo anti-HER2/neu, indicando una lieve ipertrofia cardiaca. Questi risultati sono coerenti con le scoperte cliniche secondo cui il trastuzumab provoca disfunzione cardiaca nei pazienti senza cambiamenti strutturali significativi del cuore o danni alle cellule muscolari cardiache in base ai risultati della biopsia [5].

Inoltre, è stato effettuato un test di immunofluorescenza con i cuori di topi adulti e di embrioni di topo. I livelli di proteina HER2 sono stati trovati drasticamente ridotti nei cardiomiociti dei cuori adulti. Tuttavia, le VEC nei capillari del cuore dei topi adulti mostravano ancora una notevole espressione di HER2. Successivamente, le HUVEC sono state trattate con acqua sterilizzata (controllo del solvente) o con trastuzumab per 24 ore, e i surnatanti sono stati raccolti come mezzo condizionato (mezzo di controllo, Ctrl medium o mezzo di trastuzumab, Tra medium). Il terreno Tra ha avuto un effetto minimo sulla sopravvivenza delle cellule CCC-HEH-2, ma ha inibito la contrazione di queste ultime. Come previsto, Tra-medium non ha diminuito il tasso di sopravvivenza delle iPSC-CM, ma ha inibito in modo significativo l’ampiezza della contrazione e la frequenza di battito delle iPSC-CM. Non sono stati osservati cambiamenti significativi nel potenziale di membrana mitocondriale o nelle concentrazioni proteiche dei complessi della catena respiratoria mitocondriale nei cardiomiociti dopo 24 ore di trattamento con il terreno Tra. Il mezzo Tra ha aumentato il livello di mRNA di NPPA, NPPB (peptide natriuretico di tipo A/B) e MYH7 (peptide pesante della miosina 7, β miocardico) e ha diminuito il livello di mRNA di MYH6 (peptide pesante della miosina 6, α miocardico) nelle cellule CCC-HEH-2, indicando un rimodellamento cardiaco patologico.

La PTX3 rilasciata dalle VEC promuove la disfunzione cardiaca indotta dal trastuzumab.

Per identificare i fattori chiave delle VEC che inibiscono la contrattilità dei cardiomiociti, le sostanze presenti nel mezzo delle HUVEC trattate con trastuzumab sono state analizzate mediante LC-MS/MS. In totale sono state identificate centoquaranta proteine. PTX3, una delle proteine, può essere rilasciata dalle VEC e svolgere un ruolo chiave nella disfunzione endoteliale e nel danno cardiomiocitario. È stato dimostrato che il trattamento con trastuzumab ha portato ad un aumento tempo e dose-dipendente delle concentrazioni di PTX3 nel mezzo, indicando il rilascio di PTX3 dalle HUVEC. Inoltre, le CCC-HEH-2, le cellule muscolari lisce vascolari aortiche umane e i macrofagi primari indotti dai monociti del sangue periferico umano sono risultati incapaci di rilasciare PTX3 al momento del trattamento con trastuzumab, confermando che l’aumento di PTX3 secreto proveniva dalle VEC e non da altri tipi di cellule. I risultati del test ELISA hanno mostrato che i pazienti con complicazioni cardiache, come la compromissione della funzione sistolica del cuore sinistro, la compromissione della funzione diastolica del cuore sinistro, il rigurgito tricuspidale, il rigurgito mitralico o la tachicardia, avevano livelli plasmatici di PTX3 più elevati rispetto ai pazienti senza complicazioni cardiache.

Per bloccare la funzione di PTX3 è stato utilizzato un anticorpo neutralizzante PTX3. La neutralizzazione di PTX3 ha abolito l’alterazione della contrattilità dei cardiomiociti causata dal tra-medio nel modello di digossina. Inoltre, l’anticorpo neutralizzante PTX3 è stato sufficiente per inibire la ridotta ampiezza di contrazione e la frequenza di battito delle iPSC-CM, senza influenzare la sopravvivenza. Il rilascio di PTX3 indotto da trastuzumab è stato significativamente ridotto nelle HUVEC (PTX3 KO). Il mezzo contenente trastuzumab da HUVEC (PTX3 KO) non ha inibito la contrattilità dei cardiomiociti nel modello di digossina, né ha ridotto l’ampiezza della contrazione o la frequenza di battito delle iPSC-CM.

È stato dimostrato che il tasso di sopravvivenza delle cellule CCC-HEH-2 è rimasto invariato quando sono state trattate con la proteina PTX3 ricombinante. In particolare, è stata osservata una riduzione della contrattilità stimolata dalla digossina nelle cellule CCC-HEH-2 trattate con PTX3. Inoltre, 40 ng/mL di PTX3 hanno provocato una diminuzione significativa dell’ampiezza di contrazione, ma non hanno ridotto né il tasso di sopravvivenza né la frequenza di battito delle iPSC-CM. Il trattamento di topi ICR con 20 o 100 ng di proteina PTX3 ricombinante di topo per 14 giorni ha mostrato una diminuzione della frazione di eiezione e dell’accorciamento frazionale nei topi trattati con PTX3, indicando una disfunzione cardiaca nei topi trattati con PTX3. I risultati della colorazione H&E non hanno rivelato lesioni cardiache evidenti nei cuori trattati con PTX3. Tuttavia, è stata osservata una certa deposizione di collagene nelle sezioni cardiache dei topi iniettati con PTX3. Inoltre, la colorazione WGA ha mostrato un leggero aumento delle dimensioni dei cardiomiociti nei cuori dei topi iniettati con PTX3. Tuttavia, l’iniezione di PTX3 ha avuto un effetto minimo sul rapporto tra peso cardiaco e peso corporeo o sulla frequenza cardiaca. Inoltre, la PTX3 non è risultata in grado di aumentare i livelli sierici di creatina chinasi (CK-MB), ALT o AST, che sono marcatori biochimici di lesioni cardiache o epatiche, rispettivamente. Questi risultati suggeriscono che la PTX3 è sufficiente per causare direttamente la disfunzione cardiaca senza danneggiare la struttura del cuore. È stato riportato che PTX3 può indurre una disfunzione endoteliale [15] e che il trastuzumab non ha quasi nessun effetto sulla proliferazione e sulla migrazione, ma poco sulla sopravvivenza delle HUVEC.

PTX3 provoca una segnalazione aberrante del calcio nei cardiomiociti

L’espressione di 26 geni nel cuore dei topi trattati con PTX3 è stata significativamente aumentata (≥2- o ≤0,5 volte, tasso di scoperta falso ≤0,05) rispetto ai topi di controllo, mentre l’espressione di 36 geni è stata ridotta. L’analisi Gene Ontology Pathway dei processi biologici ha rivelato l’arricchimento dei geni nei processi legati alla risposta all’ipossia, alla regolazione dell’attività dei canali del calcio ad alta tensione e all’angiogenesi. L’analisi dell’arricchimento dei set di geni ha anche confermato che le vie di segnalazione strettamente associate alla funzione cardiaca, tra cui la via di segnalazione del calcio, l’attività regolatrice dei canali del calcio, il c-AMP e il riassorbimento del calcio regolato da fattori endocrini e di altro tipo, erano più arricchite nei cuori trattati con il veicolo. La citometria a flusso con il colorante di calcio Fluo-4 AM ha rivelato che il terreno Tra e la proteina PTX3 ricombinante hanno portato ad una diminuzione del contenuto di calcio intracellulare nelle cellule CCC-HEH-2. Inoltre, la delezione del gene PTX3 nelle HUVEC ha abolito la diminuzione del contenuto di calcio intracellulare nelle cellule CCC-HEH-2 causata dal mezzo contenente trastuzumab.

L’analisi dell’arricchimento dei percorsi della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) e la mappa di calore risultante hanno mostrato l’arricchimento dei percorsi legati all’infezione patogena e alla risposta immunitaria. Questo indica un’attivazione della risposta infiammatoria nei cuori trattati con PTX3. Considerando che PTX3 promuove la risposta infiammatoria in parte attraverso la segnalazione di STAT3 [16] e che STAT3 svolge un ruolo chiave nella regolazione della segnalazione del calcio cardiaco [17,18], è stata dimostrata l’attivazione della segnalazione di STAT3 da parte di PTX3. Il mezzo Tra ha aumentato la fosforilazione di STAT3 (Y705) nelle cellule CCC-HEH-2 in modo dipendente dal tempo e dalla dose. Inoltre, il trattamento con PTX3 ha aumentato l’espressione di p-STAT3 (Y705) nei cuori. Notevolmente, il trastuzumab ha avuto un piccolo effetto diretto sulla fosforilazione di STAT3 (Y705) nelle cellule CCC-HEH-2.

L’attivazione del percorso EGFR ha portato al rilascio di PTX3 dalle VEC.

I risultati del Western blot hanno mostrato che la brefeldina A (BFA) ha inibito l’aumento dei livelli extracellulari di PTX3 indotto dal trastuzumab e ha portato all’accumulo intracellulare della proteina PTX3. Notevolmente, la 3-metiladenina (3-MA), un inibitore dell’autofagia, non ha avuto alcun effetto sui livelli di PTX3. Nel percorso di secrezione convenzionale, i peptidi di segnale alle terminazioni N delle proteine secrete sono essenziali per la secrezione [19]. Pertanto, i peptidi segnale di PTX3 sono stati previsti utilizzando il server SignalP 5.0. Per confermare questo peptide segnale, sono stati costruiti un plasmide PTX3 a lunghezza piena e un plasmide PTX3 troncato (Δ 2-16) e si è studiato il rilascio di PTX3 dalle HUVEC (PTX3-KO). La troncatura degli aminoacidi 2-16 ha impedito il rilascio di PTX3 indotto da trastuzumab, suggerendo che questo peptide è il peptide segnale di PTX3 necessario per il suo rilascio dalle VEC [4,5]. L’attivazione del percorso EGFR ha portato al rilascio di PTX3 dalle VEC.

L’aumento della trascrizione delle proteine secretorie ha promosso il loro rilascio nello spazio extracellulare. Come previsto, 75, 150 e 300 μg/mL di trastuzumab hanno aumentato i livelli di mRNA di PTX3. Rispetto al siRNA non mirato (NC), il siRNA HER2 ha aumentato il livello di mRNA di PTX3. In particolare, il siRNA HER2 ha innescato il rilascio di PTX3 nel mezzo extracellulare. L’inibizione di HER2 induce un’attivazione compensatoria del percorso EGFR [20], e la sovraespressione/attivazione di EGFR promuove le malattie e le lesioni cardiovascolari, tra cui l’ipertrofia cardiaca, la fibrosi, la disfunzione endoteliale e l’aterogenesi [21,22].

Si è scoperto che il trattamento con trastuzumab o il silenziamento del gene HER2 promuoveva la fosforilazione della tirosina (Y) 1068 dell’EGFR nelle HUVEC. I saggi di immunofluorescenza e di immunoistochimica hanno confermato l’aumento della fosforilazione di EGFR nelle HUVEC e nelle VEC del cuore, rispettivamente. Questi dati suggeriscono l’attivazione di EGFR da parte dell’inibizione di HER2 mediata da trastuzumab nelle VEC. L’EGF, il ligando dell’EGFR, ha aumentato il livello di trascrizione di PTX3 e ha promosso la secrezione di PTX3, accompagnata da un aumento della fosforilazione dell’EGFR. Un plasmide EGFR attivo è stato costruito convertendo la tirosina 1068 in acido aspartico. (D) o acido glutammico (E) mutato, designato Y1068D o Y1068E, per imitare la fosforilazione della tirosina. La sovraespressione del plasmide Y1068D o Y1068E ha portato a un marcato aumento dei livelli di mRNA e dei livelli di proteine intracellulari e secrete di PTX3.

Al contrario, sono stati utilizzati lentivirus contenenti shRNA per sopprimere l’espressione di EGFR nelle HUVEC. Il knockdown dell’EGFR ha invertito l’aumento della trascrizione e dei livelli proteici secreti di PTX3 indotto dal trastuzumab. Anche gli inibitori dell’EGFR gefitinib e AZD3759 e i doppi inibitori dell’EGFR/HER2 lapatinib, neratinib e pirotinib hanno diminuito direttamente i livelli di mRNA di PTX3 nelle HUVEC. Inoltre, gefitinib, AZD3759 e lapatinib hanno bloccato gli effetti del trastuzumab sulla trascrizione e sul rilascio di PTX3.

Il percorso EGFR media la trascrizione e il rilascio di PTX3 da parte di STAT3.

La via di segnalazione dell’EGFR, in cui diversi classici effettori a valle, tra cui STAT3, AKT, IkBα, ERK e JNK1/2, regolano la trasduzione del segnale dall’attivazione dell’EGFR, è una delle vie di segnalazione più studiate. Delle proteine testate, solo la concentrazione di STAT3 fosforilata (Y705) è aumentata con il trastuzumab. La fosforilazione di STAT3 a Y705 promuove la traslocazione di STAT3 dal citoplasma al nucleo, dove STAT3 agisce come fattore di trascrizione regolando la trascrizione dei geni bersaglio [23].

I saggi di immunofluorescenza e le analisi di frazionamento subcellulare hanno mostrato che il trastuzumab ha promosso la localizzazione nucleare di STAT3, suggerendo che il trastuzumab promuove la localizzazione nucleare di STAT3 nelle HUVEC, che è stata ulteriormente confermata da saggi immunoistochimici utilizzando sezioni cardiache trattate con trastuzumab. La sovraespressione del plasmide STAT3 ha portato ad un aumento dei livelli di mRNA e di proteine secrete di PTX3 nelle HUVEC. Inoltre, l’aumento dei livelli di mRNA e di proteine secrete di PTX3 causato dal trastuzumab è stato invertito dal silenziamento di STAT3. Il saggio di luciferasi ha mostrato che l’attività di luciferasi di PTX3 è stata regolata dal trattamento con trastuzumab. La sovraespressione del plasmide STAT3 ha aumentato l’attività della luciferasi PTX3 di 1,73 volte. Al contrario, la delezione di PTX3 ha avuto un effetto minimo sulla fosforilazione di STAT3. La capacità del trastuzumab di promuovere l’accumulo di STAT3 nella regione promotrice di PTX3 è stata confermata dalla STAT3 ChIP-qPCR (saggio di immunoprecipitazione della cromatina). STAT3 viene reclutato nella regione promotrice di PTX3 per promuovere direttamente la trascrizione di PTX3 in seguito all’attivazione del percorso EGFR indotta da trastuzumab.

Lapatinib potrebbe essere un mezzo di intervento per la cardiotossicità indotta da trastuzumab

L’aggiunta di lapatinib ha abolito gli effetti del terreno Tra sui livelli di calcio nelle cellule CCC-HEH-2. Inoltre, lapatinib ha invertito la diminuzione dell’ampiezza di contrazione e della frequenza di battito indotta dal tra-medium, senza influenzare il tasso di sopravvivenza delle iPSC-CM.

Considerando che PTX3 è il fattore chiave alla base della cardiotossicità indotta da trastuzumab, è stata determinata la variazione del contenuto di PTX3 nel siero di ratto. Rispetto al basale alla settimana zero, i livelli di PTX3 sono aumentati significativamente nel gruppo anti-HER2/neu alle settimane due e quattro, e lapatinib ha ridotto l’aumento dei livelli di PTX3 causato da anti-HER2/neu al livello del gruppo IgG.

I risultati dell’ecocardiografia hanno mostrato che l’anticorpo anti-HER2/neu ha causato disfunzione cardiaca, come evidenziato dalla diminuzione della frazione di eiezione LV e dell’accorciamento frazionale. L’aggiunta di lapatinib ha migliorato la funzione cardiaca. Non sono stati osservati cambiamenti evidenti nei marcatori del danno miocardico, compresi l’indice cardiaco, le caratteristiche istologiche e i livelli di lattato deidrogenasi, creatina chinasi e CK-MB, coerentemente con le osservazioni cliniche. Si può anche confermare che lapatinib è stato in grado di attenuare l’attivazione della via di segnalazione EFGR/STAT3 nel cuore.

Letteratura:

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