O PTX3 contribui para complicações cardíacas induzidas por traumatismos por trastuzumab

Trastuzumab, o primeiro anticorpo monoclonal humanizado que visa o receptor 2 do factor de crescimento epidérmico humano (ERBB2/HER2), é actualmente utilizado como terapia de primeira linha para tumores HER2(+). Contudo, o trastuzumab aumenta o risco de complicações cardíacas sem afectar a estrutura miocárdica, sugerindo um mecanismo diferente de cardiotoxicidade.

Trastuzumab, um anticorpo monoclonal humanizado amplamente utilizado que visa o receptor 2 do factor de crescimento epidérmico humano (HER2), mostra efeitos terapêuticos na clínica contra os cancros superexpressores do HER2. No entanto, o trastuzumab está intimamente associado ao risco de complicações cardiovasculares. Um total de 2–16% dos doentes tratados com trastuzumab sofrem uma diminuição da fracção de ejecção do ventrículo esquerdo, e 1–4% dos doentes acabam por desenvolver insuficiência cardíaca sintomática [2–4], o que limita severamente a utilização segura do trastuzumab na prática clínica. Além disso, não foi observado qualquer dano miocárdico significativo em amostras de biopsia endomiocárdica de pacientes com cardiotoxicidade de trastuzumab [5], sugerindo um mecanismo cardiotóxico complicado.

O HER2 desempenha um papel fundamental no desenvolvimento e função do coração

A inibição da sinalização de HER2 leva a danos cardiomiócitos durante o envelhecimento e sobrecarga de stress, resultando numa diminuição da sobrevivência dos cardiomiócitos. Isto sugere que o HER2 é crucial para a sobrevivência dos cardiomiócitos e para a função cardíaca. Contudo, não foi observada nenhuma alteração significativa na morte mitocondrial ou cardiomiocitária em ratos adultos com deficiência de HER2 ventricular [7]. De facto, a expressão global do HER2 em corações de ratos diminui com a idade [8], mas a expressão e função do HER2 em diferentes tipos de células dentro do coração adulto não foi demonstrada.

Estudos clínicos demonstraram que pacientes com doença vascular pré-existente são mais susceptíveis a complicações cardiovasculares induzidas pelo trastuzumab [2,9], sugerindo que o sistema vascular pode contribuir para a cardiotoxicidade relacionada com o trastuzumab. As células endoteliais vasculares (VECs) são um factor importante na manutenção da função contractil dos cardiomiócitos. Libertam moléculas de sinalização que regulam a resposta sistólica dos cardiomiócitos [10,11]. Portanto, a inibição do HER2 nos VECs pode ser uma das causas de disfunção cardíaca induzida por trastuzumab. No entanto, a expressão e função do HER2 em VECs de corações adultos permanece desconhecida.

Um estudo recentemente publicado mostrou agora que a expressão do HER2 era mais elevada em VECs adultos do que em cardiomiócitos, e identificou os VECs como as principais células alvo do trastuzumab. Verificou-se que a pentraxina 3 (PTX3) dos VECs reduzia a contratilidade dos cardiomiócitos através da inibição da sinalização do cálcio. Além disso, o STAT3 demonstrou funcionar como factor de transcrição de PTX3 e o eixo de sinalização EGFR-STAT3 em VEC demonstrou aumentar a transcrição e libertação de PTX3. O lapatinibe, um inibidor duplo EGFR e HER2, também foi encontrado para abolir o declínio da função induzida pelo trastuzumabe no LV, sugerindo uma estratégia de protecção contra a cardiomiopatia induzida pelo trastuzumabe e fornecendo uma justificação para o uso combinado do lapatinibe e do trastuzumabe na terapia do cancro [1].

Os VECs mediam a cardiotoxicidade induzida por trastuzumab

Para identificar o mecanismo cardiotóxico do trastuzumabe, o efeito directo do trastuzumabe nos cardiomiócitos foi investigado pela primeira vez. Os resultados mostraram que o trastuzumab não reduziu a sobrevivência dos cardiomiócitos. Foi criado um modelo para detectar a força contrátil das células, com base na literatura [13] e utilizando digoxina, que pode promover a contracção celular e reduzir a área de superfície plana. A área da superfície plana das células foi reduzida após a administração de digoxina tanto no grupo de controlo como no grupo de trastuzumab, sugerindo que o trastuzumab não tem efeitos deletérios directos na contracção de cardiomiócitos. Além disso, foi utilizado o modelo humano iPSC-CM e os iPSC-CMs foram tratados com trastuzumab ou adriamycin (ADR), um medicamento anticancerígeno que pode reduzir a sobrevivência e contratilidade cardiomiocitária, para gerar um grupo de controlo positivo. Após seis horas de tratamento ADR, a taxa de sobrevivência das células diminuiu significativamente. Ao contrário do ADR, o trastuzumab não reduziu significativamente a sobrevivência celular. As observações ilustram que a amplitude de contracção espontânea e a frequência de batimentos não foram afectadas pelo tratamento de trastuzumab, mas foram reduzidas pelo tratamento ADR.

Para confirmar o efeito do trastuzumab no coração, foi criado um modelo de rato com anticorpo anti-HER2/neu (homólogo do HER2 em ratos). O anticorpo anti-HER2/neu e o trastuzumab partilham semelhanças estruturais na terceira região que determina a complementaridade e têm o mesmo epitopo antigénico nos seus alvos [14]. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) não mostrou danos cardíacos óbvios nos corações de ratos tratados com anticorpos anti-HER2/neu. Foi observado um aumento da deposição de colagénio em secções cardíacas de ratos tratados com anticorpos anti-HER2/neu. A aglutinina de germes de trigo (WGA) mostrou um ligeiro aumento do tamanho dos cardiomiócitos nos corações de ratos tratados com anticorpos anti-HER2/neu, indicando uma ligeira hipertrofia cardíaca. Estes resultados são consistentes com os achados clínicos de que o trastuzumab causa disfunção cardíaca em doentes sem alterações estruturais significativas no coração ou danos nas células musculares cardíacas com base em resultados de biopsia [5].

Além disso, foi realizado um teste de imunofluorescência com os corações de ratos adultos e embriões de ratos. Verificou-se que os níveis de proteína HER2 foram drasticamente reduzidos nos cardiomiócitos dos corações de adultos. No entanto, os VECs nos capilares dos corações dos ratos adultos ainda mostravam uma expressão considerável do HER2. Posteriormente, os HUVECs foram tratados com água esterilizada (controlo de solvente) ou trastuzumab durante 24 horas, e os sobrenadantes foram recolhidos como meio acondicionado (meio de controlo, meio Ctrl ou meio trastuzumab, meio Tra). O meio Tra teve pouco efeito na sobrevivência celular do CCC-HEH-2, mas inibiu a contracção celular do CCC-HEH-2. Como esperado, Tra-medium não reduziu a taxa de sobrevivência dos iPSC-CMs, mas inibiu significativamente a amplitude de contracção e a frequência de batimentos dos iPSC-CMs. Não foram observadas alterações significativas no potencial da membrana mitocondrial ou nas concentrações proteicas dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial nos cardiomiócitos após 24 horas de tratamento com o meio Tra. Tra medium aumentou o nível de mRNA do NPPA, NPPB (peptídeo natriurético TYPE A/B) e MYH7 (miosina, peptídeo pesado 7, miocárdio β) e diminuiu o nível de mRNA do MYH6 (miosina, peptídeo pesado 6, miocárdio α) em células CCC-HEH-2, indicando remodelação cardíaca patológica.

PTX3 libertado de VECs promove disfunção cardíaca induzida por trastuzumab

Para identificar os factores-chave dos VECs que inibem a contratilidade cardiomiocitária, as substâncias no meio dos HUVECs tratados com TRANSTUZUMAB foram analisadas pelo LC-MS/MS. Foi identificado um total de cento e quarenta proteínas. PTX3, uma das proteínas, pode ser libertada por VECs e desempenhar um papel fundamental na disfunção endotelial e na lesão cardiomiocitária. Foi demonstrado que o tratamento com trastuzumab levou a um aumento das concentrações de PTX3 no meio em função do tempo e da dose, indicando a libertação de PTX3 dos HUVECs. Além disso, CCC-HEH-2, células musculares lisas da aorta vascular humana e macrófagos primários induzidos a partir de monócitos do sangue periférico humano foram considerados incapazes de libertar PTX3 aquando do tratamento com transtuzumabe, confirmando que o aumento de PTX3 segregado era de VECs e não de outros tipos de células. Os resultados de ELISA mostraram que os pacientes com complicações cardíacas, tais como a função sistólica do coração esquerdo comprometida, função diastólica do coração esquerdo comprometida, regurgitação tricúspide, regurgitação mitral ou taquicardia tinham níveis plasmáticos de PTX3 mais elevados do que os pacientes sem complicações cardíacas.

Foi utilizado um anticorpo neutralizante PTX3 para bloquear a função PTX3. A neutralização de PTX3 aboliu a contratilidade reduzida dos cardiomiócitos causada pelo tra-médio no modelo da digoxina. Além disso, o anticorpo neutralizante PTX3 foi suficiente para inibir a reduzida amplitude de contracção e frequência de batimentos dos iPSC-CMs sem afectar a sobrevivência. A libertação de PTX3 induzida por Trastuzumab foi significativamente reduzida em HUVECs (PTX3 KO). O meio que contém o trastuzumab dos HUVECs (PTX3 KO) não inibiu a contratilidade dos cardiomiócitos no modelo da digoxina nem reduziu a amplitude de contracção ou a frequência de batimentos dos iPSC-CMs.

Foi demonstrado que a taxa de sobrevivência das células CCC-HEH-2 permaneceu inalterada quando tratadas com a proteína PTX3 recombinante. Em particular, foi observada uma redução da contratilidade estimulada por digoxina nas células CCC-HEH-2 tratadas com PTX3. Além disso, 40 ng/mL PTX3 resultaram numa diminuição significativa da amplitude de contracção, mas isto não conseguiu reduzir nem a taxa de sobrevivência nem a frequência de batimentos dos iPSC-CMs. O tratamento de ratos ICR com 20 ou 100 ng de proteína PTX3 recombinante de rato durante 14 dias mostrou diminuição da fracção de ejecção e encurtamento fraccionário nos ratos tratados com PTX3, indicando disfunção cardíaca nos ratos tratados com PTX3. Os resultados da coloração de H&E não revelaram lesões cardíacas óbvias nos corações tratados com PTX3. No entanto, foi observado algum depósito de colagénio em secções cardíacas de ratos injectados com PTX3. Além disso, a coloração WGA mostrou um ligeiro aumento do tamanho dos cardiomiócitos nos corações dos ratos injectados com PTX3. No entanto, a injecção de PTX3 teve pouco efeito na relação peso cardíaco/peso corporal ou no ritmo cardíaco. Além disso, não foi encontrado um aumento dos níveis séricos de creatina cinase (CK-MB), ALT ou AST, que são marcadores bioquímicos de lesão cardíaca ou hepática, respectivamente. Estes resultados sugerem que o PTX3 é suficiente para causar directamente disfunção cardíaca sem danificar a estrutura cardíaca. Foi relatado que o PTX3 pode induzir disfunção endotelial [15], e que o trastuzumab não mostrou quase nenhum efeito na proliferação e migração, mas pouco efeito na sobrevivência dos HUVECs.

PTX3 causa sinalização aberrante de cálcio em cardiomiócitos

A expressão de 26 genes nos corações dos ratos tratados com PTX3 foi significativamente upregulada (≥2- ou ≤0.5 vezes, taxa de falsas descobertas ≤0.05) em comparação com os ratos de controlo, enquanto que a expressão de 36 genes foi desregulamentada. Gene Ontologia A análise de percursos de processos biológicos revelou enriquecimento de genes em processos relacionados com a resposta à hipoxia, regulação da actividade dos canais de cálcio de alta tensão e angiogénese. A análise do enriquecimento do conjunto genético também confirmou que as vias de sinalização estreitamente associadas à função cardíaca, incluindo a via de sinalização do cálcio, a actividade reguladora do canal de cálcio, o c-AMP e a reabsorção do cálcio regulada por factores endócrinos e outros, foram mais enriquecidas nos corações tratados com veículos. A citometria de fluxo com corante de cálcio Fluo-4 AM revelou que o meio Tra e a proteína PTX3 recombinante levaram a uma diminuição do conteúdo intracelular de cálcio nas células CCC-HEH-2. Além disso, a eliminação do gene PTX3 nos HUVECs aboliu a diminuição do teor de cálcio intracelular nas células CCC-HEH-2 causada por um meio que contém transtuzumab.

A Enciclopédia de Kyoto de Genes e Genomas (KEGG), a análise do enriquecimento das vias e o mapa de calor resultante mostraram o enriquecimento das vias relacionadas com a infecção patogénica e a resposta imunitária. Isto indica uma activação da resposta inflamatória nos corações tratados com PTX3. Considerando que o PTX3 promove a resposta inflamatória em parte através da sinalização STAT3 [16] e que o STAT3 desempenha um papel fundamental na regulação da sinalização cardíaca de cálcio [17,18], a activação da sinalização STAT3 pelo PTX3 foi demonstrada. Tra médio aumentou a fosforilação de STAT3 (Y705) em células CCC-HEH-2 de uma forma dependente do tempo e da dose. Além disso, o tratamento PTX3 aumentou a expressão de p-STAT3 (Y705) nos corações. Notavelmente, o trastuzumab teve um pequeno efeito directo na fosforilação do STAT3 (Y705) nas células CCC-HEH-2.

A activação da via EGFR levou à libertação de PTX3 de VECs

Os resultados do Western blot mostraram que a brefeldina A (BFA) inibiu o aumento dos níveis extracelulares de PTX3 induzidos pelo trastuzumab e levou à acumulação intracelular de proteína PTX3. Notavelmente, a 3-metiladenina (3-MA), um inibidor de autofagia, não teve qualquer efeito sobre os níveis de PTX3. Na via de secreção convencional, os peptídeos de sinal no N-termini das proteínas secretadas são essenciais para a secreção [19]. Portanto, os peptídeos de sinal de PTX3 foram previstos usando o servidor SignalP 5.0. Para confirmar este peptídeo de sinal, foram construídos um plasmídeo PTX3 de comprimento total e um PTX3 truncado (Δ 2-16), e foi investigada a libertação de PTX3 dos HUVECs (PTX3-KO). A truncagem dos aminoácidos 2-16 impediu a libertação de PTX3 induzida por trastuzumab, sugerindo que este peptídeo é o sinal peptídeo em PTX3 necessário para a sua libertação de VECs [4,5]. A activação da via EGFR levou à libertação de PTX3 de VECs.

O aumento da transcrição das proteínas secretoras promoveu a sua libertação para o espaço extracelular. Como esperado, 75, 150 e 300 μg/mL de trastuzumab aumentaram os níveis de mRNA de PTX3. Em comparação com o siRNA não direccionado (NC), o siRNA HER2 aumentou o nível de mRNA de PTX3. Especificamente, o HER2 siRNA desencadeou a libertação de PTX3 para o meio extracelular. A inibição do HER2 induz a activação compensatória da via EGFR [20], e a sobreexpressão/activação do EGFR promove doenças cardiovasculares e lesões, incluindo hipertrofia cardíaca, fibrose, disfunção endotelial e aterogénese [21,22].

Verificou-se que o tratamento com trastuzumab ou silenciamento do gene HER2 promoveu a fosforilação da tirosina (Y) 1068 de EGFR em HUVECs. Os ensaios de imunofluorescência e imuno-histoquímica confirmaram o aumento da fosforilação do EGFR em HUVECs e em VECs dos corações, respectivamente. Estes dados sugerem a activação do EGFR por inibição do HER2 mediada por trastuzumab nos VECs. O EGF, o ligante de EGFR, aumentou o nível de transcrição de PTX3 e promoveu a secreção de PTX3, acompanhado por um aumento da fosforilação de EGFR. Um plasmídeo EGFR activo foi construído convertendo a tirosina 1068 em ácido aspártico. (D) ou ácido glutâmico (E) mutado, designado Y1068D ou Y1068E, para imitar a fosforilação da tirosina. A sobreexpressão do plasmídeo Y1068D ou Y1068E levou a um aumento acentuado dos níveis de mRNA, bem como dos níveis intracelulares e de proteínas segregadas de PTX3.

Em contraste, lentivírus contendo shRNA foram utilizados para suprimir a expressão EGFR nos HUVECs. O knockdown do EGFR inverteu o aumento induzido pelo trastuzumab na transcrição e níveis de proteína segregada de PTX3. Os inibidores EGFR gefitinib e AZD3759 e os inibidores duplos EGFR/HER2 lapatinib, neratinib e pirotinib também diminuíram directamente os níveis de mRNA de PTX3 em HUVECs. Além disso, o gefitinib, o AZD3759 e o lapatinib bloquearam os efeitos do trastuzumab na transcrição e libertação de PTX3.

A via EGFR medeia a transcrição e libertação de PTX3 por STAT3

A via de sinalização EGFR, na qual vários clássicos efectores a jusante, incluindo STAT3, AKT, IkBα, ERK e JNK1/2, regulam a transdução de sinal da activação EGFR, é uma das vias de sinalização mais estudadas. Das proteínas testadas, apenas a concentração de STAT3 fosforilado (Y705) aumentou com o trastuzumab. A fosforilação do STAT3 em Y705 promove a translocação do STAT3 do citoplasma para o núcleo, onde o STAT3 actua como factor de transcrição regulando a transcrição dos genes alvo [23].

Ensaios de imunofluorescência e análises de fraccionamento subcelular mostraram que o trastuzumab promove a localização nuclear do STAT3, sugerindo que o trastuzumab promove a localização nuclear do STAT3 nos HUVEC, o que foi ainda confirmado por ensaios imuno-histoquímicos utilizando secções cardíacas tratadas com trastuzumab. A sobreexpressão do plasmídeo STAT3 levou a um aumento do mRNA e dos níveis de proteína secretada de PTX3 nos HUVECs. Além disso, o aumento do mRNA e dos níveis de proteína segregada de PTX3 causado pelo trastuzumab foi invertido pelo silencioso STAT3. O ensaio da luciferase mostrou que a actividade da luciferase PTX3 não era estimulada pelo tratamento de trastuzumab. A sobreexpressão do plasmídeo STAT3 aumentou a actividade da luciferase PTX3 em 1,73 vezes. Pelo contrário, a eliminação do PTX3 teve pouco efeito sobre a fosforilação do STAT3. A capacidade do trastuzumab para promover a acumulação STAT3 na região promotora de PTX3 foi confirmada pelo STAT3 ChIP-qPCR (ensaio de imunoprecipitação de cromatina). A STAT3 é recrutada para a região promotora de PTX3 para promover directamente a transcrição PTX3 após activação induzida por trastuzumab da via EGFR.

O lapatinibe pode ser um meio de intervenção para a cardiotoxicidade induzida por trastuzumab

A adição de lapatinibe aboliu os efeitos do meio Tra sobre os níveis de cálcio nas células CCC-HEH-2. Além disso, o lapatinibe inverteu a diminuição induzida pelo tra-médio na amplitude de contracção e frequência de batimentos sem afectar a taxa de sobrevivência dos iPSC-CMs.

Considerando que o PTX3 é o factor chave subjacente à cardiotoxicidade induzida pelo trastuzumabe, foi determinada a alteração do conteúdo de PTX3 no soro de rato. Em comparação com a linha de base na semana zero, os níveis de PTX3 foram significativamente aumentados no grupo anti-HER2/neu nas semanas dois e quatro, e o lapatinibe reduziu os níveis aumentados de PTX3 causados pelo anti-HER2/neu para o nível do grupo IgG.

Os resultados da ecocardiografia mostraram que o anticorpo anti-HER2/neu causou disfunção cardíaca, como evidenciado pela diminuição da fracção de ejecção do VE e pelo encurtamento fracionário. A adição de lapatinibe melhorou a função cardíaca. Não foram observadas alterações óbvias nos marcadores de danos miocárdicos, incluindo índice cardíaco, características histológicas e níveis de desidrogenase láctica, creatina cinase e CK-MB, consistentes com as observações clínicas. Também se pode confirmar que o lapatinibe foi capaz de atenuar a activação da via de sinalização do EFGR/STAT3 no coração.

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